急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損傷、MLCK/p-MLC2信號通路活性變化及其與抗菌肽的關系

馬鳳雨，曾家月，文琳，陳霞，2

1 西南醫科大學附屬醫院消化內科，四川瀘州 646000；2 成都醫學院第一附屬醫院消化內科

急性胰腺炎（AP）是消化科常見急腹癥。重癥急性胰腺炎（SAP）患者表現為胰腺壞死出血，伴有臟器功能障礙及代謝功能紊亂等，可導致多器官功能障礙綜合征，嚴重威脅患者生命健康。小腸是SAP 最易累及的器官之一，腸黏膜屏障損傷不僅參與了SAP 的全身炎癥反應及多器官損傷，其導致的腸道細菌移位也是胰腺炎后期并發感染最主要機制。腸黏膜屏障包括機械屏障、生物屏障、免疫屏障、化學屏障。機械屏障是由緊密連接蛋白與肌動蛋白細胞骨架將相鄰細胞連接起來構成。緊密連接蛋白主要由咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudin）及閉合小環蛋白（ZO）組成［1］。肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）是肌球蛋白輕鏈（MLC2）的特異性底物酶，在細胞骨架重構中起重要作用［2］。研究顯示，腸黏膜屏障損傷與緊密連接蛋白分子的降解、緊密連接蛋白分子結構的解聚和重排有關，其中磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC2）在此過程中發揮重要作用［3-4］。免疫屏障中最具有代表性的是抗菌肽。回腸的潘氏細胞是腸道中抗菌肽的主要來源，在腸道病原菌的刺激下，潘氏細胞脫顆粒釋放一系列抗菌因子，包括防御素、溶菌酶和再生胰島衍生蛋白3 家族（Reg3）蛋白等，保護隱窩細胞免受微生物感染，阻止外源微生物入侵，發揮殺菌作用，同時參與調節腸道菌群組成和腸道免疫反應［5-6］。2021 年6 月—2022 年1 月，我們通過建立AP大鼠模型，觀察大鼠腸黏膜屏障損傷情況，以及腸黏膜組織MLCK/p-MLC2 信號通路活性變化，并分析該信號通路激活與小腸抗菌肽的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠24 只，6周齡，體質量180～220 g。實驗動物及專用飼料均由西南醫科大學實驗動物中心提供，飼養于西南醫科大學動物房。飼養條件：室溫（22 ± 2）℃，每天定時換氣，保持12 h/12 h 光暗照明，飲食不限。本實驗經本院動物倫理委員會審核批準。

1.1.2 主要藥品與試劑 牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司），脂肪酶、淀粉酶ELISA試劑盒（南京建成生物技術有限公司），總RNA 純化提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Real-time qPCR 試劑盒（中國ELK Biotechnology公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國ASPEN公司）。

1.2 動物分組與造模 將大鼠按隨機數字表法分為對照組6 只、AP 組18 只。AP 組采取胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液進行造模。造模前12 h 禁食不禁水，給予3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。沿腹中線打開腹腔，找到胰膽管，在十二指腸乳頭旁用26 G 留置針穿破腸壁，進入胰管，微血管鉗夾閉肝門處胰管，以0.1 mL/min 的速度泵入5%牛磺膽酸鈉0.1 mL/100 g，2 min 后取下微血管鉗。以胰膽管周圍腫脹，局部胰腺顏色慢慢變黑、水腫伴充血判斷為造模成功。縫合傷口，關腹，術后繼續禁食不禁水。對照組僅開腹，適當翻動胰腺后關腹。

1.3 血清脂肪酶、淀粉酶含量檢測 對照組于造模后6 h，AP組于造模后6、12、24 h各取6只大鼠，經心臟穿刺采血2 mL，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min 離心15 min，離心半徑為12.5 cm，分離血清。采用ELISA法檢測脂肪酶、淀粉酶含量。

1.4 回腸黏膜組織病理學檢查 采用HE 染色法。大鼠采血后立即處死，取回腸黏膜組織標本，加入4%多聚甲醛固定，濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成4 μm厚切片。濃度梯度乙醇脫蠟至水，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，1%氨水顯藍。加乙醇伊紅復染60 s，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。采用Chiu 評分評價回腸黏膜組織病理學改變，評分標準為：0分，正常黏膜絨毛；1分，絨毛頂端上皮下出現間隙，炎癥細胞局部增多；2 分，上皮下間隙擴大，固有層局部水腫出血；3 分，固有層明顯水腫，彌漫出血，炎癥細胞皮下聚集；4分，剝脫的絨毛有固有層和擴張的毛細血管暴露；5分，固有層消化崩解、出血、潰瘍。

1.5 回腸黏膜組織Reg3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。取回腸末端腸段，-80 ℃保存。稱取0.1 g 回腸黏膜組織，冰上研磨，加入TRIzol 裂解液提取總RNA，以其為模板逆轉錄生成cDNA。以cDNA 作為模板，進行PCR 擴增。擴增引物由武漢恒意賽生物公司設計合成，見表1。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 PCR擴增引物序列

1.6 回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2、ZO-1、Claudin-1蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取0.1 g冷凍的末端回腸組織，研磨后離心取沉淀，加入裂解液提取組織蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE 電泳，上樣后80 V 電泳2 h，60 V 轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h。除去封閉液，加入稀釋后的一抗（MLCK、ZO-1、Claudin-1 一抗稀 釋比例1∶1 000；p-MLC2 一抗稀釋比例1∶500）4 ℃過夜；TBST 洗滌3次，加入稀釋后的二抗（稀釋比例1∶1 000）室溫孵育30 min。TBST 清洗，滴加電化學發光液，凝膠成像系統顯影。采用AlphaEaseFC 軟件分析目標條帶的灰度值，以GAPDH 為內參計算蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計量資料經過正態性檢驗，符合正態分布的數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步比較采用LSD-t檢驗。相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清淀粉酶、脂肪酶水平比較 AP 組造模后6、12、24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平均高于對照組（P均＜0.05）。AP 組造模后12、24 h 血清淀粉酶、脂肪酶水平高于造模后6 h，且造模后24 h高于12 h（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組血清脂肪酶、淀粉酶水平比較（ ± s）

表2 各組血清脂肪酶、淀粉酶水平比較（ ± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與造模后6 h 比較，#P＜0.05；與造模后12 h比較，△P＜0.05。

組別AP組 造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h對照組n 6 6 6 6脂肪酶（U/L）115.98 ± 13.55*136.56 ± 17.79*#158.61 ± 18.85*#△61.91 ± 9.81淀粉酶（U/dL）1 678.45 ± 115.60*1 929.29 ± 189.08*#2 395.63 ± 276.07*#△1 414.14 ± 213.51

2.2 各組回腸黏膜組織病理結果比較 對照組回腸黏膜完整，絨毛結構規整正常；AP 組回腸黏膜組織出現不同程度的損傷，包括絨毛充血、水腫、變寬變短及炎癥細胞浸潤，部分絨毛頂端破裂。AP組造模后6、12、24 h 回腸黏膜組織病理學評分分別為（1.50 ± 0.55）、（3.50 ± 0.55）、（4.83 ± 0.41）分，對照組為（0.33 ± 0.52）分，AP 組高于對照組，且造模后24 h 高于造模后6 h 及12 h，12 h 高于造模后6 h（P均＜0.05）。

2.3 各組回腸黏膜組織REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表達比較 與對照組比較，AP組造模后6、12、24 h回腸黏膜組織REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表達水平均降低，且造模后24 h 低于造模后6 h 及12 h， 12 h低于造模后6 h（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組回腸黏膜組織抗菌肽基因表達水平比較（± s）

表3 各組回腸黏膜組織抗菌肽基因表達水平比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與造模后6 h 比較，#P＜0.05；與造模后12 h比較，△P＜0.05。

組別AP組 造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h對照組n 6 6 6 6 REG3γ mRNA 0.67 ± 0.05*0.46 ± 0.03*#0.20 ± 0.04*#△0.97 ± 0.02 α-防御素5 mRNA 0.70 ± 0.04*0.55 ± 0.03*#0.32 ± 0.03*#△1.04 ± 0.03溶菌酶mRNA 0.78 ± 0.05*0.54 ± 0.04*#0.26 ± 0.02*#△0.96 ± 0.03

2.4 各組回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、MLCK、p-MLC2 蛋白水平比較 AP 組造模后6、12、24 h回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1 水平均低于對照組，AP 組造模后12、24 h 低于造模后6 h，且造模后12 h 低于造模后24 h（P均＜0.05）。AP 組造模后6、12、24 h 回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2 蛋白水平均高于對照組，AP 組造模后12、24 h 回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2 蛋白水平均高于造模后6 h，且 造 模 后24 h 亦 高 于 造 模 后12 h（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、MLCK、p-MLC2蛋白表達水平比較（± s）

表4 各組回腸黏膜組織ZO-1、Claudin-1、MLCK、p-MLC2蛋白表達水平比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與造模后6 h比較，#P＜0.05；與造模后12 h比較，△P＜0.05。

組別AP組 造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h對照組n 6 6 6 6 ZO-1 0.78 ± 0.09*0.31 ± 0.05*#0.22 ± 0.05*#△1.01 ± 0.08 Claudin-1 0.41 ± 0.05*0.16 ± 0.03*#0.08 ± 0.02*#△0.73 ± 0.02 MLCK 0.65 ± 0.06*0.84 ± 0.05*#1.08 ± 0.07*#△0.50 ± 0.05 p-MLC2 0.42 ± 0.05*0.86 ± 0.06*#1.07 ± 0.06*#△0.13 ± 0.02

2.5 AP 大鼠回腸黏膜組織MLCK、p-MLC2 蛋白表達與抗菌肽的相關性 AP 大鼠回腸黏膜組織MLCK 蛋白表達水平與REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平呈負相關（r分別為-0.96、-0.95、-0.93，P均＜0.05），p-MLC2 蛋白表達水平與REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA 水平亦呈負相關（r分別為-0.96、-0.94、-0.96，P均＜0.05）。

3 討論

小腸是AP最易累及的遠端器官之一，同時腸黏膜屏障損傷參與了AP 的發生發展［7］。有研究認為，腸黏膜屏障損傷是誘發和加重AP的癥結所在，在促發全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征中發揮重要作用，這也是SAP 病死率高的主要原因［8］。本研究結果顯示，與對照組比較，AP 組造模后各時間點血清淀粉酶和脂肪酶含量均顯著升高，表明AP大鼠模型造模成功。組織病理學檢查顯示，與對照組相比，AP組回腸黏膜組織表現為黏膜不同程度斷裂缺失、間質水腫、炎性細胞浸潤，腸道組織病理損傷評分顯著升高，且隨著造模時間延長，升高更為明顯，表明AP大鼠腸道的病理損傷呈現時間依賴性加重趨勢，有腸上皮細胞的明顯破壞。

腸黏膜機械屏障由完整的上皮細胞和細胞旁緊密連接組成，該屏障可防止細菌、脂多糖和腸桿菌群等其他有害物質從腸腔進入血液。Claudin-1、Occludin 和ZO-1 蛋白作為主要的緊密連接蛋白，能夠加強腸道屏障，降低細胞旁通透性［9］。Claudin-1、Occludin 與鄰近細胞中的其他連接蛋白相互作用形成頂端連接復合體，ZO-1 主要位于鄰近上皮細胞的邊界，將Occludin 和Claudin-1 錨定在細胞骨架上，共同控制腸黏膜屏障通透性［10］。Claudin-1、ZO-1 水平降低提示腸黏膜屏障損傷，腸黏膜通透性增加［11］。本研究結果顯示，與對照組比較，AP 大鼠回腸黏膜組織中Claudin-1、ZO-1 蛋白表達減少，提示AP大鼠存在明顯的腸黏膜屏障損傷。

腸黏膜屏障損傷不僅涉及腸機械屏障損傷，腸道通透性的改變導致細菌易位，還涉及腸壁內免疫活性細胞和鄰近淋巴結—腸道相關淋巴組織的激活。抗菌肽是腸道免疫屏障的重要組成部分。回腸的潘氏細胞是小腸上皮中高度分化的分泌細胞，可分泌調節腸道菌群的抗菌肽，維持腸道穩態和腸黏膜屏障功能。潘氏細胞分泌抗菌肽的功能受損可能是AP 發生腸黏膜屏障損傷的原因之一。動物實驗顯示，ZIP4 基因敲除鼠存在潘氏細胞功能障礙，干細胞分化微環境受到破壞，導致上皮細胞完整性缺失，腸黏膜屏障受損［12］。研究發現，潘氏細胞功能障礙與多種疾病的發生有關，如克羅恩病、酒精性脂肪肝、移植物抗宿主病和腸易激綜合征等。本研究結果顯示，與對照組相比，AP 組回腸黏膜組織中的抗菌肽REG3γ、α-防御素5、溶菌酶表達隨病程延長逐漸下降，造模后24 h 低于造模后6、12 h。這提示抗菌肽表達異常可能參與了AP 過程中腸黏膜屏障損傷的病理過程。

MLCK 是一種鈣調素依賴酶，能夠催化肌球蛋白20 kD 輕鏈的磷酸化，使肌動球蛋白得以激活肌球蛋白ATP 酶，從而引起平滑肌的收縮活動。研究認為，MLCK 是腸黏膜屏障功能障礙的關鍵效應因子和潛在的治療靶點［13］，MLCK 剪接變體可糾正炎癥性腸病動物的腸黏膜屏障功能障礙。短肌或平滑肌MLCK 在腸上皮中不表達，而長肌MLCK 在腸上皮細胞中高度表達，并通過誘導MLC2 磷酸化來調節腸道通透性［14］。腸上皮通透性主要由兩種不同的機制調節，即細胞旁途徑和經上皮途徑，由緊密連接控制的細胞旁途徑允許水、溶質和離子的通過。調節細胞旁途徑涉及四種不同的機制：緊密連接基因的轉錄調節［15］、MLCK 介導的肌肉收縮［16］、緊密連接蛋白的內吞［17］和上皮細胞凋亡［18］。此外，既往研究報道，腸黏膜屏障破壞引起的細菌滲透促進了病原體相關分子模式與模式識別受體如TLR4、TLR5 和NLRP3的結合；激活免疫細胞產生免疫反應；分泌細胞因子如IL-13和IFN-γ。WU等［19］研究顯示，過量分泌IFN-γ可增加細胞旁通透性，其中MLCK通路激活參與了這一過程。但MLCK/p-MLC2信號通路在AP腸黏膜屏障功能障礙中的作用尚不清楚。本研究結果顯示，與對照組相比，AP 組回腸黏膜組織中MLCK、p-MLC2蛋白表達水平顯著增高，造模后24 h較6 h 和12 h 增高更為明顯，表明AP 時腸道黏膜組織中MLCK激活，MLC2磷酸化，MLCK/p-MLC2信號通路可能參與了AP時的腸黏膜屏障功能障礙。

有學者在腸上皮細胞持續表達MLCK 的轉基因小鼠中評估了腸黏膜屏障功能和緊密連接功能，緊密連接蛋白的選擇性變化伴隨著Na+滲透的增加，這可能直接影響MLCK 依賴的MLC2 磷酸化，提示MLCK/p-MLC2 信號通路與腸黏膜屏障功能密切相關［20］。在免疫介導的炎癥性腸病模型中，腫瘤壞死因子受體2 信號通路刺激增加上皮長MLCK 的表達，導致緊密連接失調、屏障喪失，從而增加免疫介導的結腸炎的嚴重程度［24］。本研究通過Pearson 相關分析發現，抗菌肽的降低與MLCK/p-MLC2 信號通路呈負相關，因此推測，MLCK/p-MLC2 的表達與AP腸黏膜免疫屏障的減弱存在相關性，并由此參與了AP腸黏膜屏障損傷。

綜上所述，AP 大鼠存在腸黏膜屏障損傷，回腸黏膜組織中MLCK/p-MLC2 信號通路激活，可能導致緊密連接的破壞，其與免疫屏障如抗菌肽的分泌減少共同作用，導致腸黏膜屏障損傷。對MLCK/p-MLC2信號通路的進一步研究可為臨床治療AP腸黏膜功能障礙提供新思路。