小檗胺對人肺癌細胞增殖和凋亡能力的影響及其機制

陶荔，嚴佳棟

蘇州大學附屬張家港醫院藥學部，江蘇張家港 215600

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球發病率和致死率均位居第一，對社會和經濟造成巨大影響。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的類型。目前對肺癌的治療主要包括傳統化療、放療、靶向藥物治療，近年來免疫檢查點抑制劑的應用取得了一定的療效，但是仍然存在腫瘤耐藥、易復發以及不良反應重的難題。因此，尋找有效、安全的治療藥物是臨床迫切需要解決的問題。小檗胺是小檗科植物中提取的雙芐基異喹啉類生物堿，鹽酸小檗胺片可治療各種原因引起的白細胞減少，還具有抗心律失常、抗心肌缺血、降低心率、抗血栓等作用［1］。近年研究表明，小檗胺對多種腫瘤具有抑制作用，能夠通過內質網應激通路誘導胃癌AGS 細胞凋亡［2］；抑制肝癌細胞SMMC-7721的增殖、侵襲和轉移［3］；在體外將細胞周期阻滯在S 期，從而抑制膀胱癌的增殖和轉移［4］。目前關于小檗胺在肺癌中的研究較少，其具體作用機制尚不明確。2019 年10 月—2020 年6 月，我們通過觀察小檗胺對人肺癌A549 細胞增殖及凋亡的影響，探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株A549購買于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。小檗胺購于上海麥克林生化科技有限公司，純度＞98%，加入DMSO 配制成終濃度為100 μmol/L的儲存液。培養基RPMI-1640購于美國Corning公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；青霉素—鏈霉素溶液購于生工生物工程（上海）有限公司；MTT 試劑盒、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；結晶紫染色液購于北京索萊寶科技有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 購于美國Cell Signaling 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 二抗購于上海碧云天生物技術有限公司。多功能酶標儀購于美國Thermo 公司；流式細胞儀購于美國BD 公司；凝膠成像系統購于美國BIO-RAD公司。

1.2 細胞培養 取A549 細胞，加入含有10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的RPMI1640 培養基中，置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，每1～2 天更換培養液。當細胞融合達到80%～90%時，PBS 洗滌，加入含EDTA 的胰酶消化，然后加入10% RPMI1640培養基終止消化，反復吹打使得細胞形成單細胞懸液。將細胞進行傳代培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用MTT 法。取對數生長期細胞制成單細胞懸液，按1.0×105/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為對照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入10、20、40 μmol/L 小檗胺，對照組加入等體積培養基。分別于培養24、48、72 h 后，取細胞加入MTT 溶液，37 ℃孵育4 h，加入100 μL DMSO 振蕩混勻。上酶標儀，在450 nm 波長處測定每孔的OD 值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=小檗胺處理組OD 值/對照組OD值×100%。

1.4 細胞克隆形成能力觀察 采用平板克隆實驗。取對數生長期細胞制成單細胞懸液，按1×103/孔接種于6 孔板中，每孔2 mL，置于培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為對照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，對照組加入等體積培養基。培養7 d后，棄培養基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，加入結晶紫染色液染色10 min。滅菌水洗滌，室溫晾干。用數碼相機拍照，光學顯微鏡下觀察含有50個以上細胞的克隆，計算克隆形成率。克隆形成率=細胞克隆數/接種細胞數×100%。

1.5 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。將對數生長期細胞制成單細胞懸液，按1.0×105/mL 接種于6孔板中，每孔2 mL，置于培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為對照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，對照組加入同等體積的培養基。培養48 h 后，收集各組細胞，PBS 洗滌，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。加入195 μL Annexin V-FITC 結合液重懸，再加入5 μL Annexin VFITC，最后加入10 μL PI 染色液，室溫孵育20 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 以及PI3K/AKT 信號通路蛋白檢測 采用Western blotting 法。取對數生長期細胞制成單細胞懸液，按2.0×105/mL 接種于6 孔板，每孔2 mL，置于培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為對照組和小檗胺組，小檗胺組分別加入含10、20、40 μmol/L 小檗胺，對照組加入等體積培養基。培養48 h 后，收集各組細胞，PBS 洗滌，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解20 min，12 500 r/min 離心15 min，收集上清，BCA法對各組細胞總蛋白定量。每組取40 μg蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 抗體（Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 稀釋比例為1∶1 000，GAPDH 稀釋比例為1∶5 000），4 ℃孵育過夜。第2 天TBST 洗3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。TBST 洗3 次，將1∶1 混合的ECL 發光液均勻滴至PVDF 膜上，用BioRad 凝膠成像儀獲取圖像。用Image J 軟件對灰度值進行分析，以目的蛋白與內參GAPDH 的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量，以p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K表示蛋白磷酸化水平。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。采用Shapiro-Wilk法對計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。重復測量資料采用重復測量方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間細胞增殖情況比較 小檗胺組經10、20、40 μmol/L 小檗胺處理24、48、72 h 的細胞存活率均較對照組降低，40 μmol/L 小檗胺處理48、72 h的細胞存活率較24 h降低，20 μmol/L小檗胺處理72 h 的細胞存活率較24、48 h 降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組不同時間點細胞存活率比較（%，± s）

表1 兩組不同時間點細胞存活率比較（%，± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與24 h 比較，#P＜0.05；與48 h 比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對照組細胞存活率24 h 86.91 ± 4.95*71.36 ± 2.66*64.68 ± 2.10*100.00 ± 1.76 48 h 89.29 ± 6.29*67.02 ± 2.29*53.05 ± 4.03*#100.00 ± 2.53 72 h 79.00 ± 3.22*56.54 ± 4.20*#△47.10 ± 1.57*#100.00 ± 3.19

2.2 各組細胞克隆形成情況比較 小檗胺組經10、20、40 μmol/L 小檗胺處理后的細胞克隆數和克隆形成率較對照組降低，其中20 μmol/L 處理后較10 μmol/L 降低，40 μmol/L 處理后較10、20 μmol/L降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞克隆數及克隆形成率比較（ ± s）

表2 各組細胞克隆數及克隆形成率比較（ ± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與10 μmol/L 小檗胺組比較，#P＜0.05；與20 μmol/L小檗胺組比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對照組細胞克隆數（個）203 ± 12*136 ± 16*#85 ± 9*#△310 ± 15克隆形成率（%）65.65 ± 5.95*43.88 ± 3.09*#27.37 ± 1.87*#△100.00 ± 5.19

2.3 各組細胞凋亡率比較 小檗胺組經10、20、40 μmol/L小檗胺處理后的細胞凋亡率分別為11.01% ± 0.09%、29.32% ± 0.18%、39.52% ± 0.29%，對照組為5.48% ± 0.23%。10、20、40 μmol/L 小檗胺處理后細胞凋亡率較對照組增加，其中20 μmol/L 處理后較10 μmol/L 升高，40 μmol/L 處理后較10、20 μmol/L升高（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 表達水平比較 與對照組相比，小檗胺組經10、20、40 μmol/L小檗胺處理后細胞Bax、Caspase-3表達水平升高，Bcl-2表達水平降低；其中高濃度小檗胺處理后的細胞Caspase-3表達水平較低濃度小檗胺升高，Bcl-2表達水平較低濃度小檗胺降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平比較 （% ± s）

表3 各組細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平比較 （% ± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與10 μmol/L 小檗胺組比較，#P＜0.05；與20 μmol/L小檗胺組比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對照組Bax 117.50 ± 2.02*122.31 ± 3.94*147.64 ± 2.08*#△100.00 ± 2.01 Bcl-2 80.19 ± 5.58*42.84 ± 6.37*#22.80 ± 4.94*#△100.00 ± 3.91 Caspase-3 108.43 ± 2.39*130.50 ± 1.66*#156.80 ± 3.75*#△100.00 ± 2.95

2.5 各組細胞PI3K、AKT 蛋白磷酸化水平比較 與對照組相比，小檗胺組經10、20、40 μmol/L 小檗胺處理后細胞PI3K、AKT 磷酸化水平均降低；其中高濃度小檗胺處理后的細胞PI3K、AKT 磷酸化水平較低濃度小檗胺降低（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組細胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平比較（ ± s）

表4 各組細胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平比較（ ± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與10 μmol/L 小檗胺組比較，#P＜0.05；與20 μmol/L小檗胺組比較，△P＜0.05。

組別小檗胺組 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L對照組p-AKT/AKT 0.602 ± 0.028*0.513 ± 0.024*#0.437 ± 0.053*#△1.000 ± 0.035 p-PI3K/PI3K 0.846 ± 0.052*0.638 ± 0.038*#0.541 ± 0.070*#△1.000 ± 0.043

3 討論

近年來，隨著靶向藥物和免疫治療的發展，肺癌的治療取得了一定進展，但肺癌仍然是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤［5］。很多肺癌患者在發現時已經是晚期或者有轉移，失去手術機會。傳統化療藥物不良反應大，容易耐藥，而靶向藥物和免疫治療藥物也存在耐藥和復發的問題。中醫藥因高效、毒性小的特點而被廣泛研究，一些中藥制劑已經應用到臨床實踐［6］。小檗胺是從藥用植物小檗科中提取的天然小分子化合物，可用于治療白細胞減少癥，對心血管疾病也有一定作用［7］。近年研究表明，小檗胺對多種腫瘤具有抑制作用。MENG 等［8］研究發現，小檗胺可以通過Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ有效抑制肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。WANG 等［9］報道，小檗胺可通過調控AKT 和NF-κB 信號通路，抑制高轉移性乳腺癌細胞的侵襲、遷移和增殖能力。金穎等［10］報道，小檗胺可以抑制胰腺癌細胞增殖并促進細胞凋亡。本研究觀察了不同濃度小檗胺對肺癌A549 細胞增殖和凋亡的作用，結果表明，小檗胺能夠顯著抑制細胞存活率，減少細胞克隆數和克隆形成率，促進細胞凋亡。這表明小檗胺對人肺癌A549 細胞有增殖抑制和促凋亡的作用。

細胞凋亡是一種程序性死亡，在抑制腫瘤的發生和發展中起著重要的調控作用。誘導細胞凋亡主要有2 種途徑，一種是由細胞間信號激活的內在途徑，即線粒體途徑；一種是由細胞外信號激活的外在途徑，即死亡受體途徑［11］。Bcl-2 以及Bcl-2 家族成員Bax 是細胞凋亡中作用于線粒體的關鍵調控分子，Bcl-2 可以保護細胞膜通透性，抑制細胞凋亡，而Bax 作用與Bcl-2 作用相反，通過調節細胞線粒體膜的通透性，促進細胞色素C 的釋放，激活Caspase 級聯反應，導致細胞凋亡［12］。Caspase 家族蛋白被活化進而發生凋亡蛋白酶的級聯反應是細胞凋亡的重要過程，Caspase-3 是其家族重要成員之一，是Caspase 級聯反應下游的關鍵凋亡執行者，Caspase-3 的激活依賴于細胞色素C 的釋放，最終促進細胞凋亡［13］。本研究結果顯示，小檗胺處理組Bax 和Caspase-3 的蛋白表達量高于對照組，Bcl-2的蛋白表達量低于對照組，以上結果提示小檗胺可能是通過調控Bcl-2、Bax 以及Caspase-3 的表達從而促進肺癌細胞凋亡。

PI3K/AKT 信號通路是參與細胞代謝、增殖以及凋亡中的重要信號通路之一，在多種疾病如腫瘤、糖尿病、心血管疾病和神經系統疾病中發揮重要作用［14-17］。PI3K 是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，當受到酪氨酸激酶或G 蛋白偶聯受體的激活后，將底物PIP2 轉化為PIP3。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K 信號通路中的一個重要下游靶點，PIP3 作為第二信使，與AKT 的N 端PH 結構域結合，使AKT 從胞質轉移到細胞膜上，最終導致AKT 磷酸化而活化，進一步激活下游信號通路，調控細胞增殖、凋亡等過程［18］。谷田露等［19］報道，金雀異黃酮通過調控PI3K/AKT 信號通路抑制肺癌細胞增殖和侵襲轉移。孟東雪等［20］報道，扶正抑瘤湯可以通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制非小細胞肺癌增殖、凋亡及自噬。本研究結果顯示，小檗胺組PI3K、AKT 蛋白磷酸化水平低于對照組，表明小檗胺可能是通過PI3K/AKT 信號通路誘導細胞凋亡。

綜上所述，小檗胺可以抑制人肺癌A549細胞的增殖、降低細胞克隆數和克隆形成率、誘導細胞凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT 信號通路有關。本研究為發現新的肺癌治療藥物提供了理論依據。