基于組織芯片技術探討GLUT10在主動脈夾層發病機制中的作用

簡麗娟 吳 琪 陳遠洋 邢凱 胡知朋

主動脈夾層(aortic dissection,AD)是指主動脈內的血液從主動脈內膜撕裂處進入主動脈中膜，使中膜分離，沿主動脈長軸方向擴展形成主動脈壁的真假兩腔分離狀態，一旦治療不及時，病死率極高，它具有起病急驟、病情兇險等特點，是一種極為兇險的心血管疾病。AD的發生、發展與許多流行病學因素有關，其中最常見的誘因有高血壓、年齡、血脂異常和結締組織的遺傳疾病等。一般情況下，其病理過程復雜，與主動脈中層退行性變及主動脈壁炎性細胞浸潤密切相關，以血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)丟失、破裂、失效為特征[1]。及早發現、早期干預、及時治療對AD患者預后有極大的幫助，因此，有必要了解其具體發病機制。

GLUT10的編碼基因SLC2A10單基因突變容易導致動脈迂曲綜合征，主要表現為大中動脈的延長、彎曲和狹窄，并有動脈夾層形成的傾向。在組織病理學上，它與動脈壁中的彈性纖維碎裂和組織混亂有關[2]。GLUT10在VSMC中高度表達，并部分定位于線粒體。Syu等[3]研究表明，GLUT10靶向線粒體對維持VSMC中氧化還原穩態、線粒體結構和線粒體功能至關重要。GLUT10的錯義突變會損害VSMC中的線粒體靶向性，表現為活性氧水平升高、線粒體破碎、線粒體功能受損以及細胞增殖和遷移增強。

本研究通過人體組織芯片實驗和GLUT10慢病毒敲低VSMC進行轉染來研究主動脈組織中GLUT10的表達水平與AD的相關性和機制。

對象與方法

1.研究對象：選取2018年1～11月于武漢大學人民醫院確診為AD患者并行全主動脈弓置換的27例患者為夾層組，所有患者均經過計算機體層攝影血管造影(computed tomography angiography，CTA)檢查確診為AD。納入標準：①符合AD診斷標準[4]；②年齡>18歲；③病史清晰；④標本完整；⑤患者知情同意。排除標準：①合并肝臟、腎臟等其他重要器官疾病；②合并惡性腫瘤；③合并其他血管疾病。患者均在入院后行急診手術，術中取AD患者病變組織。組織取出后用預冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗，部分凍存于液氮中，部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于制作組織芯片。另選取18例心臟移植患者作為對照組(此18例患者均無大血管疾病，其在心臟移植術中取下的心臟主動脈血管可作為相對正常主動脈血管組織)。術前所有實驗方案均已告知家屬，并簽署知情同意書，本研究經武漢大學人民醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號: WDRY2015-K021)。

2.實驗細胞來源及病毒轉染：原代血管平滑肌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，將購得的細胞培養瓶放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中靜置3～4h以穩定細胞狀態，吸出培養基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞1次；添加0.25%胰酶1ml至T25培養瓶中，輕微轉動培養瓶至胰酶覆蓋整個培養瓶底后，吸出多余胰酶，37℃溫浴1～3min；顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后，再加入5ml DEM/F12培養基終止消化；用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種于60mm×15mm培養皿中傳代，然后補充新鮮的DEM/F12培養基至3ml，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中靜置培養；待細胞完全貼壁后，在顯微鏡下觀察VSMC的形態進行鑒別，培養穩定后進行傳代，對傳代細胞隨機分為兩組：GLUT10敲低組加入適量GLUT10慢病毒及助轉染試劑，對照組加入適量對照慢病毒及助轉染試劑，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中靜置轉染，48h取出至新倒置顯微鏡下觀察細胞轉染情況，隨機拍片，后提取細胞蛋白用于后續實驗。

3.實驗試劑：GLUT10抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；GLUT10慢病毒、助轉染試劑均購自山東維真生物科技有限公司；Vinculin抗體、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體、鈣調寧蛋白(calponin 1, CNN1)抗體、平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α, SM22α)抗體、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體、抗兔二抗均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

4.Western blot法檢測：按照分組要求處理細胞后，加入含有適量比例Cocktail及PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用細胞刷刮凈細胞至1.5ml EP管中，所得樣品置于冰上超聲碎裂。根據所獲得蛋白上清液的體積，以適當的比例加入5×蛋白上樣緩沖液混勻，100℃金屬浴15min, 所獲蛋白樣本凍存于-80℃冰箱中。每孔蛋白上樣量為5μg，電泳電壓90V，電流40mA，以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行Western blot法電泳。在電流200mA、電壓100V條件下，電轉2.5h。其后PBST洗膜，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃搖床孵育過夜，以Vinculin為內參，以山羊抗兔熒光二抗顯影，在Odessy熒光掃膜系統上掃膜，并對結果進行半定量分析。

5.免疫組化實驗：各組標本經4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后進行切片。選取適量切片后將其置于65℃恒溫烘箱中加熱融蠟2h，然后放入二甲苯溶液中脫去殘留的石蠟，進行常規的水化步驟后用PBS漂洗。用Triton試劑破膜15min，而后在枸櫞酸緩沖溶液中進行微波加熱修復。自然冷卻后，用3%過氧化氫溶液消除內源性過氧化物酶，血清常溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜。室溫復溫1h，二抗避光孵育1h。用DAB染色液在顯微鏡下顯色，顯色后蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，漂洗干凈后進行風干，中性樹脂封片，最后在全自動顯微鏡下觀察拍照。

6.統計學方法：應用Graghpad統計學軟件對數據進行統計分析，至少取5次獨立實驗結果。計量資料的兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.組織芯片中主動脈組織的GLUT10表達：組織芯片的免疫組化染色發現，夾層組患者的主動脈組織中GLUT10的表達(棕色代表陽性信號)較對照組低，且夾層組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖1、圖2)。

圖1 夾層組和對照組GLUT10的免疫組化染色A.夾層組(×30)；B.夾層組(×400)；C.對照組(×30)；D.對照組(×400)

圖2 組織芯片中夾層組和對照組GLUT10表達差異的統計圖

2.GLUT10慢病毒轉染VSMC后相關蛋白的表達：用GLUT10慢病毒轉染VSMC 48h后，在新倒置顯微鏡下觀察，發現VSMC轉染成功(圖3)，提取細胞蛋白進行Western blot法檢測，發現GLUT10敲低組PCNA、MMP2的表達水平較對照組增高，而GLUT10、α-SMA、SM22α、CNN1表達水平均較對照組明顯下降，且差異均有統計學意義(圖4)。

圖3 GLUT10敲低組和對照組病毒轉染細胞成功結果A.GLUT10敲低組；B.對照組

圖4 轉染細胞提取蛋白Western blot法實驗結果A.Western blot法檢測VSMC中GLUT10、CNN1、α-SMA、SM22α、PCNA、MMP2、Vinculin的表達結果；B.GLUT10敲低組和對照組中相關蛋白的表達差異

討 論

《2021年中國心外科手術和體外循環數據白皮書》顯示，近年來我國主動脈夾層診斷數量迅速攀升，這既是診斷水平提高的結果，也體現了現代生活方式下AD發病水平增高，由傳統觀念中的“罕見病”轉成了“常見病”[5]。AD是人體最兇險、病死率最高的疾病，其一旦破裂，患者將在幾分鐘內死亡，無法搶救。如果沒有及時發現和救治，AD患者發病后48h內病死率為50%～68%，發病3個月內病死率高達90%[6]。明確AD發病機制對AD的早期預防和救治均至關重要，但其發生、發展過程錯綜復雜，主要以主動脈中膜退行性變為基礎，伴主動脈炎性細胞浸潤、平滑肌細胞增殖、遷移、表型轉化、氧化應激、細胞外基質降解等病理生理過程，共同促進AD的發生、發展。

GLUT10作為一種葡萄糖轉運體蛋白，通過轉運葡萄糖等營養物質進入組織內，從而使組織獲得能量，維持機體生命所需。有研究表明，GLUT10是脫氫抗壞血酸的轉運體，其基因突變可使平滑肌細胞的氧化應激產物水平明顯升高，線粒體碎片化和功能受損[3,7]。當GLUT10功能缺失時，其可能通過上調動脈壁中的轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路誘導細胞增殖減少、上皮間充質轉化、細胞外基質紊亂導致血管重塑[8～10]。

本研究結果發現，AD患者的主動脈組織中的GLUT10的表達水平較正常主動脈組織明顯降低，提示GLUT10的表達在一定條件下調節主動脈生物學功能，其表達的降低將會使主動脈的正常功能紊亂，促進AD的發生、發展。GLUT10不僅在人VSMC中高度表達，還在大鼠VSMC中表達[11,12]。既往研究發現，GLUT10基因的功能缺失突變會導致動脈迂曲綜合征，這是一種常染色體隱性遺傳病，以動脈迂曲、動脈瘤和大中型動脈狹窄為特征。特別是在動脈迂曲綜合征患者中，GLUT10突變導致了主動脈VSMC中GLUT mRNA/蛋白的顯著下調和動脈中層彈性纖維的破壞，并伴有轉化生長因子-β信號的上調[13]。Lee等[14]研究表明，在VCSM中表達的GLUT10介導氧化形式的維生素C轉運到線粒體，從而保護血管細胞免受氧化應激。因此，GLUT10通過葡萄糖轉運以外的機制維持血管壁的完整性，在血管系統中發揮著關鍵作用。為了進一步驗證GLUT10在主動脈中的作用，本研究對大鼠的VSMC用GLUT10慢病毒敲低進行了轉染，轉染后Western blot法檢測顯示，GLUT10表達水平較對照組明顯降低，證明GLUT10慢病毒轉染有效。

AD的發病是由多種病理變化相互作用導致，其中主要的病理變化為VSMC的增殖紊亂，VSMC表型由收縮型向分泌型轉化以及細胞外基質的大量降解[15～17]。PCNA與細胞DNA合成密切相關，是反映細胞增殖狀態的良好指標[18]。α-SMA、SM22α、CNN1是平滑肌細胞的主要標志物，作為收縮蛋白參與細胞骨架的構成[19,20]。MMP能夠水解細胞內的各種蛋白，其水平的升高可導致細胞外基質大量降解，細胞功能受損，其中MMP2和MMP9與AD的發病密切相關[21,22]。為了進一步研究GLUT10在AD中的作用，本研究對提取的轉染細胞蛋白進行上述相關蛋白檢測，發現GLUT10慢病毒敲低轉染的細胞中細胞周期蛋白PCNA及MMP2的表達較對照轉染組明顯增高，而骨架蛋白α-SMA、SM22α、CNN1較對照組明顯下降，提示GLUT10與VSMC的增殖、表型轉換以及細胞外基質降解等有關，進一步說明GLUT10在維持主動脈血管平滑肌細胞正常生物學功能中發揮重要作用，缺失致主動脈重構、增加主動脈夾層易感性。

綜上所述，GLUT10表達對主動脈夾層的發生、發展具有重要作用，維持GLUT10在血管平滑肌細胞中的表達水平對主動脈夾層的預防及治療都是非常有益的。未來可以通過監測主動脈平滑肌細胞中GLUT10的表達水平來預測主動脈疾病的發病風險。對GLUT10在主動脈夾層中的具體發病機制進一步探索，GLUT10特異性表達于血管平滑肌細胞，有望成為主動脈夾層治療的新靶點。