miR-217調節Runx2/OPN在鈦顆粒誘導小鼠脛骨骨溶解中的作用

張曉倩，王鵬皓，郭磊

（中國醫科大學附屬第一醫院骨科，沈陽 110001）

假體周圍骨溶解（periprosthetic osteolysis，PPOL）是影響人工假體壽命的主要限制因素之一。研究［1］發現，全髖人工關節置換術后約5.5%的患者和3.1%的全膝人工關節置換術患者接受了PPOL導致的翻修手術。人工關節的翻修手術具有巨大的挑戰性，可能伴隨嚴重的并發癥［2］。最近的研究［3］表明，假體-骨界面產生的磨損顆粒誘發慢性炎癥并破壞骨穩態，誘發PPOL，進而導致假體無菌性松動，因此，防止PPOL的關鍵在于抑制磨損微粒誘導的骨溶解反應。研究［4］顯示，微RNA（microRNA，miRNA）參與的基因調控對靶基因的表達可產生廣泛影響。miR-217在腎小球系膜細胞、乳腺癌上皮細胞和肝癌細胞中發揮多種生物學功能［5］。本研究擬構建小鼠脛骨PPOL模型，探討miR-217在鈦微粒誘導骨溶解中的作用機制，以期為PPOL的防治提供新靶點和組織工程化相關數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

12周齡成年雄性C57BL/6小鼠（購自中國醫科大學實驗動物中心）40只，體質量（25±2）g。兔抗鼠矮小相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）抗體、抗骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體（美國 Sigma公司），GAPDH抗體（北京中杉金橋生物有限公司），miR-217 mimics（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司），TRIzol試劑（美國Thermofisher公司），ABIPrism7500序列檢測系統（美國Beyotime公司）。

1.2 磨損顆粒制備

100%無水乙醇浸泡去內毒素處理后鈦顆粒，離心，紫外線下照射24 h，浸泡于無菌 PBS，4 ℃放置待用。

1.3 動物模型建立

采用針植入加鈦顆粒手術方法建立小鼠脛骨PPOL動物模型。10%水合氯醛腹腔注射（30 mg/kg）麻醉小鼠，選擇右膝關節髕骨旁內側切口，長度5 mm，暴露脛骨平臺，0.8 mm牙鉆鉆孔至脛骨骨髓腔，孔直徑1 mm，深5 mm。用鈦合金針將10 μL鈦顆粒懸浮液（4×104個鈦顆粒）注入脛骨髓腔，對位分層縫合，建立小鼠脛骨PPOL動物模型；術后1 d，將小鼠隨機分為對照組和實驗組，每組20只。實驗組注射miR-217 mimics 50 μL（1.86 μg/μL）于PPOL區 域，對照組注射50 μL PBS。

1.4 micro-CT掃描

針植入加鈦顆粒術后1周和2周時，分別取2組小鼠脛骨骨組織，行micro-CT掃描及micro-CT自帶軟件（SkyScan1176，比利時Kontich公司）檢測分析脛骨顯微結構參數［骨密度、骨礦物質含量和骨體積比（bone volume ratio，BV/TV）］。

1.5 實時定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

用TRIzol試劑提取總RNA，Nanodrop2000測定RNA濃度和純度。用primematipt混合RT隨機引物逆轉錄mRNA。用TRIzol逆轉錄miRNA。采用Prime-Script RT Master Mix和ABIPrism7500序列檢測系統行cDNA擴增。以GAPDH和U6作內參照，每個樣品重復3次。用2-ΔΔCt法分析相對表達量。采用不同引物檢測環狀RNA的后剪接，采用聚合引物檢測線性mRNA。miRNA和mRNA引物序列見表1。

表1 miRNA和mRNA檢測引物序列Tab.1 Primer sequences for miRNA and mRNA expression assays

1.6 Western blotting

采用放射免疫沉淀法提取總蛋白。8%或10%SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜。加入兔抗鼠Runx2（1∶250）和OPN（1∶250）抗體，孵育過夜。PBS洗膜后加入過氧化物酶耦聯的二抗，37 ℃下孵育2 h，PBS清 洗后，用FDbio-Femto ECL和Bio-Rad化學發光系統檢測目的條帶。以GAPDH抗體（1∶2 500）作內參照。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 針植入加鈦顆粒手術對PPOL動物的影響

本研究中，采用針植入加鈦顆粒手術構建PPOL小鼠模型。手術后0～2周，實驗組所有PPOL小鼠的行為、飲食水量與對照組小鼠無差異，手術區下肢膝關節切口處無感染流膿，PPOL區域未見骨折和鈦顆粒溢出。

2.2 miR-217對PPOL小鼠脛骨骨性微結構的影響

miR-217 mimics注入實驗組小鼠脛骨骨溶解病變處1周時，PPOL脛骨內骨溶解有明顯減弱（圖1）；2周時，實驗組小鼠脛骨的骨密度、骨礦物質含量及BV/TV均較對照組顯著升高（圖2），差異有統計學意義（P＜ 0.05）。表明miR-217 mimics可有效改善PPOL小鼠脛骨的骨溶解病理效應。

圖1 2組小鼠脛骨micro-CT形態學結構 ×5Fig.1 Morphological structure in tibia of mice in 2 groups ×5

圖2 miR-217 mimics對PPOL小鼠脛骨微結構的影響Fig.2 Effects of miR-217 mimics on tibia microarchitecture in PPOL mice

2.3 miR-217干預 PPOL小鼠骨組織內Runx2/OPN mRNA和蛋白的表達

miR-217 mimics注入PPOL模型脛骨骨溶解病變處1周時，Runx2、OPNmRNA和蛋白的表達水平顯著升高（圖3、4）；注入2周時，PPOL小鼠脛骨骨組織內Runx2、OPNmRNA表達水平顯著高于1周時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖3 miR-217 mimics對PPOL小鼠脛骨組織內Runx2/OPN mRNA表達的影響Fig.3 Effect of miR-217 mimics on Runx2/OPN mRNA expression in the tibial tissue of PPOL mice

3 討論

PPOL是導致人工關節置換手術失敗的主要原因。假體磨損產生的微粒能誘導骨髓巨噬細胞和破骨細胞過度分泌炎性細胞因子，在假體周圍形成異物（肉芽腫性界膜組織），進而發生無菌性炎癥，使得骨質溶解破壞失代償，最終導致假體松動［6］。

圖4 miR-217 mimics對PPOL小鼠脛骨組織內Runx2/OPN蛋白表達的影響Fig.4 Effect of miR-217 mimics on the expression of Runx2/ OPN protein in the tibia tissue of PPOL mice

PPOL是關節置換術的主要長期并發癥，嚴重影響人工關節假體的使用壽命。人工假體周圍組織中骨轉換的平衡不僅取決于破骨細胞介導的骨吸收，還取決于成骨細胞形成新骨，這2個過程在生理條件下維持體內平衡［7］。研究［8］證實，Runx2/OPN在骨髓間充質干細胞的成骨分化、骨組織的骨質形成和基質鈣化過程中具有重要作用，而Runx2蛋白可抑制炎性細胞因子誘導的PPOL。本研究結果顯示，外源性miR-217作用PPOL小鼠2周后，可顯著提高PPOL小鼠脛骨的骨密度及骨礦物質含量，有效改善PPOL小鼠脛骨的骨溶解病理效應。

miRNA具有單鏈非編碼RNA分子穩定結構，通常以細胞和組織特異性的方式發揮作用。隨著高通量RNA測序技術和生物信息學的發展，大量的研究［9］證實miRNA參與多種疾病的發生與進展。miR-384-5p可通過直接與Gli2mRNA的3’-UTR端結合，抑制Gli2mRNA和蛋白的表達水平，具有成骨負調節作用［10］；miR-132-3p可能通過Smad5調節成骨細胞對周期性張應力的分化［11］；miR-124 mimics可以通過靶基因Sp7調節成骨細胞內成骨相關基因ALP和OCN的表達［12］。MENSà等［13］發現，由衰老的人臍靜脈內皮細胞的外泌體攜帶的miR-21-5p/miR-217可傳遞促衰老信號，影響mRNA和DNA的甲基化，進而影響內皮細胞的增殖。目前尚未見miRNA參與骨溶解病理效應的相關報道。本研究結果顯示，在PPOL小鼠脛骨骨組織內，外源性miR-217 mimics可顯著增強Runx2和OPN的蛋白表達，改善鈦顆粒誘導的PPOL效應。

Runx2和OPN是成骨細胞內成骨關鍵分子，在骨形成過程中具有重要的調控作用。Runx2屬于RUNX家族的一員，是脊椎動物中的關鍵調控蛋白，參與胚胎發育發育、造血、血管發生、腫瘤發生和免疫反應。Runx2在骨穩態中也起著重要作用。有關男性骨質疏松性骨折的研究［14］發現，Runx2可能是調控人類皮質和骨小梁體積骨密度的潛在骨形成遺傳靶點。YANG等［15］發現，Runx2在骨折早期修復過程中表達水平升高，使得破骨細胞的活性增強。OKA等［16］報道，敲除Runx2基因會使小鼠骨礦化受損，導致骨骼發育不良和骨質疏松表型。在破骨細胞中，miR-217可抑制RANKL和CXCL12的表達，從而抑制破骨細胞活性，促進骨鈣鹽沉積［17］；miR-217還可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進成骨細胞的分化成熟［18］；但 miR-217在PPOL中對OPN/Runx2的作用還不明確。本研究探討了miR-217對成骨細胞因子OPN/Runx2的干預作用，證實在小鼠PPOL脛骨骨組織內miR-217可促進OPN/Runx2 的蛋白表達，增加PPOL小鼠的骨密度，從而抑制PPOL效應。

綜上所述，本研究系統性地探討了鈦顆粒誘導的小鼠PPOL病理過程中miR-217對脛骨骨組織成骨作用的影響，發現miR-217 可促進脛骨骨組織內Runx2和OPNmRNA和蛋白表達，顯著增高脛骨骨密度及骨礦物質含量，有效改善PPOL小鼠脛骨的骨溶解病理效應。