基于網絡藥理學和分子對接預測大黃治療胃癌的作用機制

何欣，劉云鵬，李冬陽，車曉芳

（1.中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，沈陽 110001；2.遼寧省腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

胃癌是全世界范圍內常見的惡性腫瘤［1］，我國胃癌發病率呈逐年遞增趨勢［2］。由于胃癌本身的特點，大多數患者就診時已為中晚期，且目前治療效果欠佳，5年生存率僅為35.1%［3］。胃癌患者普遍營養狀態和體能較差，對于手術、放化療等治療手段帶來的不良反應發生率較高，在治療過程中聯合中藥治療胃癌，能緩解放化療不良反應、改善患者生活質量。研究［4］表明中藥對胃癌的轉移和復發有一定的抑制作用。

大黃，味苦性寒，具有沉降之性，以及瀉下攻積，涼血解毒，清熱瀉火，活血祛瘀的功效，適用于癌癥的治療［5］。大黃的化學成分大約有160多個，主要分8個類別，其中大黃酸、大黃素、蒽酮衍生物等具有明顯抗腫瘤作用，主要通過抑制腫瘤細胞增殖和促進其凋亡發揮作用［6］。然而，大黃在胃癌中發揮抗腫瘤作用的關鍵成分和關鍵作用靶點尚不十分清楚。因此，本研究擬將疾病-藥物-成分-靶點聯成網絡，通過網絡藥理學和生物信息學的方法，探討大黃在胃癌中發揮抗腫瘤作用的機制和潛在靶點，以期為其抗腫瘤機制的深入研究及臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 獲取大黃活性成分及其靶點

通過檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數 據庫［7］，在“Herb name”中以“大黃”進行檢索，然后以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-like，DL）≥0.18為標準進一步篩選，最終獲得大黃的活性成分。利用TCMSP獲取大黃活性成分靶標蛋白，逐一通過UniProtKB數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行檢索，將蛋白名稱轉化為對應的基因名稱。

1.2 胃癌靶基因獲取

從癌癥基因組圖譜數據庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）獲取胃癌組織及癌旁組織的mRNA表達信息，使用rawcount格式數據，利用R軟件的DESeq2包進行差異分析獲得差異基因，以log2 foldchange絕對值＞1且P＜ 0.05作為標準進一步篩選。利用GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）檢索關鍵詞“gastric cancer”保留Score＞5分的基因，將2個數據庫的檢索結果進行合并去重得到胃癌的潛在治療靶點。

1.3 大黃治療胃癌的靶基因獲取

將大黃潛在活性化合物的作用靶點和胃癌的潛在治療靶點輸入TBtools軟件，取交集最終獲得“大黃-胃癌”的交集靶點，繪制韋恩圖。

1.4 疾病-藥物-成分-靶點網絡建立

應用Cytoscape 3.7.2軟件［8］將疾病、藥物、活性成分、交集基因之間的關系和相互作用繪制成網絡圖，分別標注不同顏色，用連線表示其之間關聯，并進行可視化處理輸出圖片。

1.5 交集靶基因富集分析

利用潛在作用靶點，使用Metascape網站（https：//metascape.org/）［9］進行京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路、基因本體論（gene ontology，GO）分類富集分析（參數設置為Min Overlap：3；PValue Cutoff：0.01；Min Enrichment：1.5），挖掘大黃治療胃癌的作用機制。其中，GO富集分析根據生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）類別對靶點進行注釋和分類。

1.6 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析

應用Metascape網站進行PPI分析，并根據MCODE算法識別功能密切關聯的關鍵基因簇。

1.7 分子對接

從Protein Data Bank數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb）中檢索獲得關鍵基因簇中基因編碼的蛋白結構文件，通過pubchem網站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲取關鍵基因對應的大黃的活性成分的SDF結構文件，利用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 獲取大黃活性成分

通過TCMSP數據庫共檢索到大黃已報道的成分92個，從其中篩選口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18的潛在活性化合物共16個（表1）。16個活性成分中僅有10個（MOL002235，MOL000471，MOL000096，MOL002268，MOL002281，MOL002288，MOL002280，MOL002259，MOL000358，MOL002297）能夠檢索到對應的靶點，對10個活性成分的靶點合并去重得到110個最終靶點，將110個靶點的蛋白名稱在Uniprot數據庫中轉化為相應的基因名稱，共得到55個基因靶點。

表1 大黃的活性成分Tab.1 Active ingredients of Rheum officinale

2.2 大黃治療胃癌靶基因獲取

通過TCGA獲得胃癌數據庫中癌和癌旁的差異基因5 739個，通過GeneCards網站獲得胃癌相關基因2 951個，兩者并集合計7 886個基因。將大黃潛在活性成分的作用靶點與胃癌的潛在治療靶點取交集獲得46個基因，利用TBtools軟件繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 大黃與胃癌交集基因韋恩圖Fig.1 Venn picture of intersecting targets

2.3 疾病-藥物-成分-靶點網絡建立

利用Cytoscape軟件繪制胃癌-大黃-活性成分-靶點網絡圖，其中靶點為46個交集基因（圖2）。對應的靶基因數目排名前3位的分別為β-谷甾醇24個、蘆薈大黃素19個、澤蘭黃醇12個。這一結果提示，β-谷甾醇、蘆薈大黃素和澤蘭黃醇可能是抑制胃癌的主要成分。

圖2 胃癌-大黃-活性成分-靶點網絡圖Fig.2 Gastric cancer-Rheum officinale-active component-targets network

2.4 交集靶基因富集分析

富集分析結果顯示，大黃的抗胃癌靶點涉及多種作用途徑，分析結果按照P值排序。GO富集分析篩選后發現，主要涉及的生物過程包括凋亡信號通路，對缺氧的反應，程序性細胞死亡的正向調節，MAPK通路調節等（圖3）。KEGG富集分析經過篩選后發現，與胃癌相關的通路包括癌癥信號通路，細胞周期通路，PI3K-Akt信號通路等（圖4）。因此，大黃可能通過抑制細胞周期、促進凋亡來抑制胃癌細胞增殖。

圖3 大黃治療胃癌靶點的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

圖4 大黃治療胃癌靶點的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

2.5 PPI網絡分析

PPI分析結果保留STRING方法中physical score＞0.132的節點，繪制PPI網絡圖。利用MCODE算法分析得到的4個功能相對集中的子網絡基因簇，其中紅色標記組分值最高，該基因簇包括BCL2、CASP8、AR、IL1B、CASP3、PRKCA、TP53、CDKN1A、PCNA（圖5）。

圖5 功能基因組圖Fig.5 Key subnetwork gene clusters

2.6 分子對接

為證明靶點蛋白與大黃活性成分間的結合活性，將關鍵基因簇中的9個基因BCL2、CASP8、AR、IL1B、CASP3、PRKCA、TP53、CDKN1A、PCNA與其對應的活性成分分別進行分子對接。AutoDock Vina的結果以一種親和能（Affinity）的形式輸出，能值越低，兩者的結合效果越好，11組對接結果顯示親和能都較好（表2），其中PRKCA與蘆薈大黃素結合能最大。PRKCA與aloe-emodin之間的結合模式圖如圖6A所示，通過計算結果顯示，氨基酸殘基Glu418、Val420與aloe-emodin分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Ala366、Met417、Asp481、Phe350、Ala480、Val353、Met470、Tyr419、Leu345與aloe-emodin分子形成疏水相互作用（圖6B）。上述結果提示，蘆薈大黃素靶向PRKCA促進細胞凋亡可能是大黃在胃癌中發揮抗腫瘤作用的最關鍵機制。

圖6 PRKCA與蘆薈大黃素的對接圖Fig.6 The docking diagram of PRKCA type and aloe-emodin

表2 大黃活性成分與靶點白分子對接結果Tab.2 Docking and binding result of compounds with targets

3 討論

本研究利用網絡藥理學技術，整體分析評價了大黃與胃癌的可能作用關系，并預測了大黃作用于胃癌的可能分子機制。大黃的活性成分中蘆薈大黃素、β-谷甾醇、澤蘭黃醇在網絡中對應的靶點較多，可能在后續研發抗腫瘤新藥的過程中成為先導化合物。劉豪杰等［10-12］研究證明蘆薈大黃素可能通過激活p53/AMPK/mTOR信號通路，增強細胞自噬水平，促進SGC-7901細胞凋亡，還可以阻滯SGC-7901細胞在G0/G1期，抑制其增殖能力，降低遷移和侵襲能力，并通過抑制Notch-1/AKT/NF-κB信號通路誘導細胞凋亡，隨后又發現蘆薈大黃素可能通過抑制腫瘤細胞EMT及改善Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路來抑制胃癌SGC-7901細胞遷移及侵襲能力。

通過分析獲得大黃治療胃癌的潛在靶點共46個，GO富集分析結果包括凋亡信號通路，對缺氧的反應，程序性細胞死亡的正向調節，MAPK通路調節等。KEGG富集分析包括癌癥信號通路，細胞周期通路，PI3K-Akt信號通路等。進一步進行PPI分析及MCODE算法分析，得到4個功能相對密集的基因簇，其中評分最高一組包含的基因為BCL2、CASP8、AR、IL1B、CASP3、PRKCA、TP53、CDKN1A、PCNA。在這9個基因中，多個基因與凋亡相關，且在凋亡信號通路上起到至關重要的作用。BCL2在許多癌癥中高度上調，使其成為癌癥治療的理想靶標，目前也有Bcl-2抑制劑正在進行臨床研究，例如，Bcl-2/Bcl-xl抑制劑APG-1252-M1在6種胃癌細胞中均觀察到誘導凋亡的作用［13］。CASP8編碼的caspase-8是控制細胞凋亡、壞死性凋亡和細胞焦亡的分子開關。CASP8的表達還能觸發ASC斑點的形成、caspase-1的激活和白細胞介素-1β（IL1B編碼）的分泌［14］。通過對胃癌術后患者的標本進行caspase-3免疫組化，發現胃癌患者中caspase-3的表達與良好的臨床病理特征和根治性手術后的積極預后有關［15］。

綜上所述，富集分析結果表明大黃可以通過影響凋亡、程序性細胞死亡、MAPK通路調節、細胞周期、PI3K-Akt信號通路等多種生物途徑發揮抗胃癌功能，影響胃癌患者預后，其中凋亡通路起到重要作用。因此推測大黃的主要成分之一蘆薈大黃素通過靶向PRKCA促進胃癌細胞凋亡是大黃在胃癌中發揮抗腫瘤作用的關鍵。當然這一推測還需要進一步的細胞模型和動物模型的驗證。本研究通過數據挖掘和分子對接對大黃治療胃癌進行分析，為今后大黃治療胃癌的進一步研究奠定了基礎。