不同檢驗方法在HPV陽性患者分流中的效能

張詩敏，王敏

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

宮頸癌是女性常見的癌癥之一。據統計2020年全球約有604 000例新發宮頸癌病例［1］。近年來，因宮頸癌篩查的推廣及應用，宮頸癌的發病率及死亡率較前明顯下降。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）已經被明確為導致宮頸癌的主要原因［2］。HPV檢測因具有靈敏度較高、受檢測人員主觀因素影響小的特點，被廣泛應用于宮頸癌的初篩中。但是，與細胞學檢測相比，HPV檢測對宮頸癌及癌前病變早期篩查的特異度較低。為避免過度檢查與治療，目前急需一種可以用于HPV陽性患者分流的檢測方法［3］。

DNA甲基化作為一種癌癥檢測的生物標志物，目前被廣泛應用于多種癌癥的的篩查［4-5］。有研究表明，PAX1甲基化與口腔癌、宮頸癌、結直腸癌、甲狀旁腺癌相關，鋅指蛋白582（zinc finger protein 582，ZNF582）甲基化可應用于口腔癌、鼻咽癌的檢測。本研究將PAX1、ZNF582甲基化檢測、HPV定量檢測、HPV16/18分型檢測、液基細胞學檢測用于HPV篩查陽性患者的分流，探討不同檢測方法對HPV陽性患者分流的能力以及對宮頸癌及癌前病變的診斷效能。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2018年12月至2021年10月就診于中國醫科大學附屬盛京醫院門診，且自愿要求行宮頸癌機會性篩查的女性作為研究對象。納入標準：（1）年齡19～69歲，有過性生活史的女性；（2）無臨床可疑的懷孕癥狀；（3）HPV分型檢測結果為陽性；（4）廢棄的液基細胞學檢測剩余樣本有足夠的殘留量用于DNA甲基化檢測及HPV定量檢測。排除標準：（1）宮頸病變治療史（如子宮切除術等）；（2）惡性腫瘤病史或其他嚴重疾病史。

對有異常宮頸癌初篩結果的患者行陰道鏡檢測，由有經驗的陰道鏡醫師判斷患者是否需要進一步于陰道鏡下行宮頸活檢。由2名有經驗的病理醫師對宮頸活檢的病理結果進行診斷，以宮頸活檢的病理結果作為本研究的診斷標準。對患者的液基細胞學檢測后廢棄樣本行PAX1和ZNF582甲基化檢測及HPV定量檢測。最終共計有110例HPV陽性患者納入研究。病理組織活檢結果如下：良性/慢性子宮頸炎（n=31），宮頸上皮內瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）1（n=41），CIN2（n=17），CIN3（n=15），宮頸惡性腫瘤（n=6）。本研究獲得醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 HPV分型檢測：采用HPV核酸擴增分型檢測試劑盒（21種HPV核酸分型檢測，廣東凱普生物科技股份有限公司），通過快速導流雜交技術對樣本進行HPV基因分型檢測。

1.2.2 液基細胞學檢測：利用全自動新柏氏液基細胞學制片儀將樣本制成薄層細胞涂片，按照2014版The Bethesda System分類法作為診斷標準，由2名以上有經驗的醫師進行細胞學檢測結果的診斷。

1.2.3 HPV定量檢測（DH3檢測）：采用雜交捕獲-化學發光法（DH3系統，杭州德同生物技術有限公司）進行高危型HPV檢測。結果判定標準：相對光單位/截斷值（relative light unit/cut-off，RLU/CO）＞1 μg/mL為陽性。

1.2.4 DNA甲基化檢測：按照試劑盒（PAX1及ZNF582甲基化檢測試劑盒，湖南宏雅基因技術有限公司）說明書進行操作。實驗完成后導出數據，并進行結果分析。DNA甲基化水平評估指數（M-index）=10 000×2-ΔCp。ΔCp≤9為高度甲基化，ΔCP ＞ 9為低度甲基化。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行數據的統計分析。將病理為良性/慢性宮頸炎及CIN1設為CIN1-組，CIN2、CIN3、宮頸惡性腫瘤設為CIN2+組。將病理為良性/慢性宮頸炎、CIN1及CIN2設為CIN2-組，將CIN3、宮頸惡性腫瘤列為CIN3+組。分別采用χ2和兩樣本秩和檢驗分析不同檢測方法對CIN1-組和CIN2+組以及對CIN2-組和CIN3+組的檢測效能。同時繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線計算不同檢驗方法的截斷值，采用Spearman相關分析探討不同分流方法與宮頸病變之間的相關性。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者的基本特征

本研究共納入HPV陽性患者110例，平均年齡（43.66±1.16）歲，平均初次懷孕年齡（24.48±3.16）歲。按照活檢病理結果，CIN1-組72例，CIN2+組38例，2組患者在初次懷孕年齡方面存在統計學差異（Z=2.038，P=0.042），CIN1-組與CIN2+組患者在文化程度、性生活開始年齡、接觸性出血史、妊娠次數、宮頸癌篩查史、吸煙史方面均不存在統計學差異。見表1。

表1 患者的基本特征［n （%）］Tab.1 Patients’ basic characteristics ［n（%）］

2.2 不同檢測方法對HPV陽性患者的分流效能

將液基細胞學檢測結果中未見上皮內病變細胞和惡性細胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）設為檢驗陰性，結果為無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）設為檢驗陽性，CIN1-組與CIN2+組以及CIN2-組與CIN3+組的液基細胞學結果比較，均無統計學差異。CIN1-組和CIN2+組、CIN2-組與CIN3+組PAX1及ZNF582甲基化檢測結果比較，均有統計學差異。CIN1-組與CIN2+組以及CIN2-組與CIN3+組PAX1甲基化檢測、ZNF582甲基化檢測、DH3（16/18）檢測、HPV16/18分型檢測結果比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同檢測方法對HPV陽性患者的分流效能Tab.2 Triage efficacy of different triage methods for cervical lesions in HPV positive subjects

2.3 不同檢測方法對HPV陽性患者的診斷效能

對PAX1和ZNF582甲基化檢測行ROC曲線分析，結果顯示，PAX1甲基化檢測CIN2+曲線下面積為0.735（0.634～0.837），且P＜ 0.001。ZNF582甲基化檢測CIN2+曲線下面積為0.803（0.711～0.895），且P＜0.001。不同檢測方法對HPV陽性患者的診斷效能包括診斷的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確性、截斷值見圖1、表3。

表3 不同分流方法對HPV陽性患者的診斷效能Tab.3 Diagnostic efficacy of different triage methods in identifying HPV-positive women

圖1 PAX1和ZNF582的ROC曲線Fig.1 The receiver operating characteristic curve of PAX1 and ZNF582 methylation

2.4 甲基化檢測與宮頸活檢病理的Spearman相關分析

Spearman相關分析結果表明，PAX1甲基化檢測與宮頸活檢病理之間存在相關性（r=0.451，P＜0.001）；ZNF582甲基化檢測與宮頸活檢病理之間也存在相關性（r=0.516，P＜ 0.001）。

2.5 不同宮頸病變患者的PAX1及ZNF582甲基化水平比較

結果顯示，隨著研究對象宮頸病變病理等級的升高，PAX1甲基化水平評估指數及ZNF582甲基化水平評估指數也逐漸升高。病理等級為CIN3+的研究對象的PAX1及ZNF582甲基化水平評估指數較病理等級為CIN2-的研究對象顯著升高，見圖2。

圖2 不同病理等級的甲基化水平指數Fig.2 Methylation level evaluation index of different pathological grades

3 討論

HPV檢測因具有較高的靈敏度已逐步取代細胞學檢測，成為女性宮頸癌的初篩方法。但相比于細胞學檢測，HPV檢測也存在特異度低等缺點。多數HPV病毒感染是非致癌性的，且絕大多數HPV感染會在2年內消除［6］。因此，各國學者正在努力尋求分流HPV檢測陽性女性的方法。

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，目前已經在多種癌癥的早期診斷中發揮重要作用［3］。PAX1在脊椎動物胚胎發育過程中有重要作用，PAX1啟動子甲基化與多種腫瘤的發生發展和轉移相關，并且已在口腔癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤的診斷中表現出良好的診斷靈敏度和特異度，逐漸成為癌癥早期檢測與預測復發的潛在生物學標志物。目前，PAX1甲基化在一些亞洲宮頸癌篩查研究［7-8］中展現出較好的檢測效能。但絕大多數研究未探討PAX1甲基化對HPV陽性人群的分流作用。本研究結果顯示，PAX1甲基化檢測在HPV陽性患者分流中有一定的作用。研究［9］表明，PAX1甲基化與宮頸病變進展以及宮頸癌的發生相關，宮頸病變越重，PAX1甲基化水平越高。本研究顯示，隨著HPV檢測陽性患者宮頸病變病理等級的升高，PAX1甲基化水平評估指數逐漸升高，與既往研究結果一致。目前也有關于ZNF582甲基化在宮頸癌篩查中作用的研究［10］，結果發現，ZNF582甲基化水平隨著宮頸病變加重而升高。

本研究結果還發現，PAX1及ZNF582甲基化檢測較細胞學（ASCUS+）檢測對CIN2+有更好的特異性及陽性預測值，提示PAX1及ZNF582甲基化檢測在HPV陽性患者的分流及宮頸病變篩查中可能發揮更好的作用。為日后DNA甲基化檢測用于HPV陽性患者的分流及宮頸病變篩查提供了有利的證據。

本研究的不足之處在于樣本量較小，本課題組后續將擴大樣本量繼續相關研究。目前也有關于啟動子甲基化與宮頸癌之間相關機制的研究［11-12］，為更好地證實PAX1及ZNF582甲基化與宮頸癌及癌前病變的相關性，今后將對相關機制進行研究。此外，未來將對已證實為宮頸癌前病變及宮頸癌患者進行隨訪，進一步觀察患者的后續結局與相應的DNA甲基化水平之間的關系。