硒對高糖誘導的大鼠腹膜透析相關腹膜纖維化的影響

高利麗，蔡宏宇，劉彤崴

（錦州醫科大學附屬第一醫院 1.腎內科；2.心內科，錦州 121001）

腹膜透析是一種有效的居家腎臟替代療法，全球約有196 000例終末期腎病患者接受腹膜透析治療，占透析人群的11%～15%［1］。盡管隨著透析方式和設備的改進，感染性腹膜炎的發病率明顯降低，但腹膜透析相關腹膜纖維化仍是腹膜透析最主要的并發癥，嚴重影響腹膜透析的效能，是患者退出腹膜透析的主要原因。腹膜作為半透膜，長期暴露于高糖腹膜透析液中可導致腹膜氧化應激的發生，最終導致腹膜纖維化［2］。硒是人體內一種重要的微量元素，具有抗氧化特性，可保護生物系統免受氧化損傷。低硒與多種疾病的發生、進展密切相關，如腎病、肝纖維化等。本研究通過觀察硒對高糖誘導的大鼠腹膜透析相關腹膜纖維化的影響，探討硒延緩腹膜透析相關腹膜纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

選用清潔級健康雄性SD大鼠40只，體質量200～250 g，8～10周齡。將大鼠隨機分為對照組（NC組）、高糖組（HG組）、低硒組（HG+L-Se組）、高硒組（HG+H-Se組），每組10只。NC組腹腔注射無菌生理鹽水（100 mL/kg），1次/d；HG組腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液（100 mL/kg），1次/d；HG+L-Se組腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液（100 mL/kg）和3 mg/kg亞硒酸鈉，1次/d；HG+H-Se組腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液（100 mL/kg）和6 mg/kg亞硒酸鈉，1次/d。各組大鼠均連續腹腔注射28 d。4.25%葡萄糖腹膜透析液由廣州百特醫療用品有限公司提供。

1.2 檢測指標和檢測方法

連續腹腔注射28 d后，給予大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。量取腹腔流出液，計算超濾量。眼球取血5 mL，靜置，3 500 r/min離心10 min，分離血清，用于谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性檢測。留取壁層腹膜組織，用于HE染色和免疫組織化學染色。

1.2.1 腹膜超濾量：準確量取腹腔流出液，計算腹膜超濾量，腹膜超濾量（mL/kg）=（1 h后腹腔流出液的體積-初始腹腔注射腹膜透析液體積）/體質量。

1.2.2 HE染色：大鼠腹膜組織經4%多聚甲醛固定24 h后，常規脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋切片，行HE染色，觀察病理表現，每張切片隨機選取5個視野。

1.2.3 免疫組織化學染色：石蠟包埋的大鼠腹膜組織4 μm切片，利用檸檬酸緩沖液高壓修復，一抗上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）（1∶100）、波形蛋白（vimentin）（1∶500）4 ℃孵育過夜。染色結束后，于倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，按陽性比例進行評分。評分標準：陰性，0分；≤20%，1分；＞20%～50%，2分；＞50%～80%，3分；＞80%～100%，4分。

1.2.4 氧化應激指標：按照GSH、MDA、T-SOD檢測試劑盒（南京建成科技有限公司）說明書進行操作，檢測大鼠血清中GSH和MDA的含量，T-SOD活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 硒對大鼠腹膜功能的影響

腹膜超濾功能結果顯示，與NC組相比，HG組1 h腹膜超濾量明顯減少（P＜ 0.05），HG+L-Se組、HG+H-Se組減少不明顯（P＞ 0.05）；與HG組相比，HG+L-Se組1 h腹膜超濾量增加，但差異無統計學意義（P＞ 0.05），而HG+H-Se組1 h腹膜超濾量明顯增加（P＜ 0.05）；HG+H-Se組與HG+L-Se組比較，1 h腹膜超濾量無統計學差異（P＞ 0.05）。見表1。

表1 4組大鼠腹膜超濾量、腹膜厚度、EMT相關蛋白表達的比較Tab.1 Comparison of peritoneal ultrafiltration volume，peritoneal thickness，and EMT-related protein expression in four groups of rats

2.2 硒對大鼠腹膜組織形態學的影響

HE染色結果（圖1）顯示：NC組大鼠腹膜組織覆蓋一層扁平間皮細胞；HG組腹膜厚度增加，間皮下基質疏松，炎癥細胞浸潤纖維，膠原大量沉積；而HG+L-Se組、HG+H-Se組上述腹膜形態較HG組明顯改善。通過Image-Pro Plus軟件分析腹膜厚度，結果顯示，與NC組相比，HG組腹膜厚度明顯增加（P＜ 0.05），HG+L-Se組、HG+H-Se組增加不明顯（P＞0.05）；與HG組相比，HG+L-Se組腹膜厚度減少，但差異無統計學意義（P＞ 0.05），HG+H-Se組腹膜厚度明顯減少（P＜ 0.05）；HG+H-Se組與HG+L-Se組比較，腹膜厚度無統計學差異（P＞ 0.05）。見表1。

圖1 4組大鼠腹膜組織HE染色 ×200Fig.1 HE staining of rat peritoneum in the four groups ×200

2.3 硒對大鼠腹膜組織EMT的影響

免疫組織化學染色結果（圖2）顯示：與NC組相比，HG組E-cadherin蛋白表達明顯降低，vimentin蛋白表達明顯增加（均P＜ 0.05）；與HG組相比，HG+L-Se組E-cadherin蛋白表達增加，vimentin蛋白表達降低，但差異無統計學意義（均P＞ 0.05），HG+H-Se組E-cadherin蛋白表達明顯增加，vimentin蛋白表達明顯降低（均P＜ 0.05）；HG+L-Se組、HG+H-Se組與NC組比較，HG+H-Se組與HG+L-Se組比較，E-cadherin蛋白和vimentin蛋白的表達均無統計學差異（均P＞0.05）。見表1。

圖2 免疫組織化學染色檢測4組大鼠腹膜E-cadherin和vimentin的表達 ×200Fig.2 Expression of E-cadherin and vimentin in rat peritoneum in the four groups determined by immunohistochemistry ×200

2.4 硒對大鼠血清MDA和GSH含量、T-SOD活性的影響

與NC組比較，HG組大鼠血清MDA含量明顯增加，GSH含量、T-SOD活性明顯降低（均P＜ 0.05）；與HG組比較，HG+L-Se組血清MDA含量降低，GSH含量、T-SOD活性升高，但差異均無統計學意義（均P＞0.05），HG+H-Se組血清MDA含量明顯降低，GSH含量、T-SOD活性明顯升高（均P＜ 0.05）；HG+L-Se組、HG+H-Se組與NC組比較，HG+H-Se組與HG+L-Se組比較，MDA含量、GSH含量、T-SOD活性均無統計學差異（均P＞ 0.05）。見表2。

表2 4組大鼠血清MDA和GSH含量、T-SOD活性的比較Tab.2 Serum levels of MDA，GSH，and T-SOD in four groups of rats

3 討論

目前，越來越多的終末期腎病患者選擇腹膜透析治療。但長期接觸非生理性腹膜透析液會引起腹膜形態和功能的改變，導致腹膜透析相關的腹膜纖維化，引發超濾失敗。研究［3］表明，腹膜纖維化早期機制是腹膜間皮細胞EMT，其具有可逆性。EMT的主要特征是上皮細胞表型喪失，如E-cadherin降低等。細胞骨架由細胞角蛋白轉化，以vimentin為主，并產生大量的細胞外基質成分膠原等。因此，本研究通過向大鼠腹腔注入4.25%葡萄糖透析液［4］，成功建立大鼠腹膜纖維化模型，并將vimentin和E-cadherin蛋白表達作為EMT的生物標志物。

氧化應激存在于慢性腎臟疾病的早期階段。正常情況下，酶系統如T-SOD、GSH等能迅速清除體內過多的氧自由基，阻斷氧自由基堆積引起的細胞損害，并修復受損的細胞。GSH作為活性氧清除劑，能夠調節細胞內的氧化還原狀態。隨著腎功能的惡化，氧化應激逐漸增強，腎臟替代治療會進一步加重氧化應激。有研究［5］指出，腹膜透析患者體內氧化應激反應的發生比透析前的終末期腎病患者增加更多。腹膜透析液中的終末期產物能夠引起腹膜氧化應激的發生，其通過多種途徑產生大量活性氧，導致纖維連接素表達上調，細胞外基質沉積，炎癥介質釋放，促纖維化細胞因子如轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β、TGF-α、血管內皮生長因子等高表達，最終導致腹膜纖維化［6］。研究［7-9］表明，在慢性阻塞性肺疾病等疾病中，氧化應激可以促進EMT的發生。由于氧化應激產生的TGF-β、TNF-α等細胞因子與EMT密切相關，因此氧化應激是腹膜EMT的一個危險因素。

抗氧化劑可改善上述變化。研究［10］發現，腎小管上皮缺氧時可通過氧化應激導致EMT，而肝纖維化中星狀細胞可通過降低脂質過氧化水平，抑制氧化應激反應，逆轉其向肌纖維母細胞的轉化。硒是人類必需的微量元素，它可以減輕炎癥反應，維持免疫系統功能。硒缺乏會導致免疫系統功能障礙，增加透析患者的心血管疾病死亡風險［11］。硒還具有抗氧化特性，補充硒可以減輕氧化應激和炎癥狀態［12］。硒是抗氧化防御機制的重要成分，也是谷胱甘肽過氧化物酶的必需成分，谷胱甘肽過氧化物酶在GSH或其他硫醇的共同作用下，清除活性氧，保護膜結構，保護脂蛋白、DNA等生物大分子，參與炎癥調節等作用。研究［13］發現，硒缺乏會導致腎臟中硒濃度降低，氧化應激水平增加，從而導致足細胞受損，濾過屏障受損，產生蛋白尿。而補充硒可增加谷胱甘肽過氧化物酶的含量，減少活性氧自由基的生成，從而減輕腎臟足細胞的氧化損傷。一些研究［14-15］表明，接受持續不臥床腹膜透析患者的硒濃度低于健康對照者，且硒缺乏程度與氧化應激密切相關。據此推測，硒可能通過抑制氧化應激反應來抑制EMT，進而調控腹膜纖維化的進程。

本研究發現，補充硒可改善腹膜透析大鼠的腹膜功能，延緩腹膜纖維化，主要表現為增加腹膜超濾量，降低腹膜厚度，減少炎癥細胞浸潤。免疫組織化學結果進一步提示，與EMT相關的vimentin蛋白表達在補硒治療后降低，而E-cadherin蛋白表達升高，說明硒可以逆轉腹膜透析大鼠腹膜的EMT進程。而血清MDA含量在補硒治療后明顯降低，GSH含量、T-SOD活性提高。由于MDA是脂質過氧化物產物，而GSH、SOD是氧自由基的清除劑，其含量改變提示硒的抗氧化作用可能是通過激活抗氧化酶、改善氧化應激過程而實現的，其可能通過阻斷氧化應激發揮潛在的腹膜保護作用，且濃度越高效果越明顯。因此，補充硒可以改變組織抗氧化酶活性，抑制氧化應激反應，進而抑制大鼠腹膜間皮細胞的EMT。

綜上所述，本研究表明，硒可通過上調血清中GSH含量、T-SOD活性，減少MDA蓄積，從而改善機體氧化應激，阻抑大鼠腹膜間皮細胞EMT。這為硒在腹膜透析相關腹膜纖維化中的作用和機制提供了新的科學依據，其具體機制仍需進一步探討。