梓醇對氧糖剝奪/復氧復糖損傷成熟人神經母細胞瘤細胞的修復作用及其機制

劉燕，高春辰，，厲勵，馮清華，吳明華，李文磊

1 南京中醫藥大學附屬醫院 南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京210023；2 東部戰區空軍醫院；3 南京中醫藥大學附屬醫院/江蘇省中醫院

最新的流行病學數據顯示，每年約有1 500 萬人遭受腦血管病的折磨，其中約80%為缺血性腦卒中患者［1］。由于條件限制，很大一部分缺血性腦卒中患者因錯過最佳溶栓或取栓時間窗而導致嚴重后遺癥［2］，這些患者肢體運動功能障礙發病率高達90%［3］，即使經過康復治療，60%的患者依舊存在持續性的肢體功能障礙［4］，嚴重影響其生活自理能力，還可能導致卒中后焦慮、抑郁、社會疏離等多種并發癥［5］，給患者及其家庭和社會都帶來沉重負擔。已有研究［6］表明，通過促進疾病條件下受損的神經元芽生或再生成為新的軸突，重塑神經網絡，或通過誘導未分化的神經元細胞向病灶周圍遷移，代替壞死神經元建立新的神經環路，可顯著改善缺血性腦卒中的預后。誘導由神經元遷移、軸突發芽再生、側支形成、新突觸形成介導的神經組織再生重塑是缺血性腦卒中長期有效的治療方法，但是臨床尚無療效確切的藥物，因此探索促進軸突生長的藥物及其機制是現代神經醫學面臨的緊要問題。

據文獻報道，梓醇在保護神經、促進軸突生長進而改善缺血性腦卒中癥狀方面具有一定的積極作用。梓醇能夠保護大腦神經系統，抑制大鼠缺血再灌注后神經元凋亡，從而減少大腦損傷［7］，促進大鼠皮質脊髓束重塑和軸突芽生，同時可促進皮質神經元軸突增長，進而促進偏癱患側肢體感覺及其活動能力的恢復。以上研究提示梓醇對神經細胞具有保護作用，同時對神經再生修復和肢體運動功能的恢復具有促進作用，但具體的作用機制尚不明確。課題組前期研究發現PTEN、mTOR 是控制軸突內在生長能力的關鍵信號通路，而OPN、IGFR 與PTEN 的相互作用能夠調控mTOR 信號通路，進而激活軸突內在生長能力，以促進軸突的發芽和生長［8］。SH-SY5Y 細胞在形態結構和生理功能方面與神經細胞有共同之處，在ATRA 誘導下SH-SY5Y可成功分化為成熟神經元，適合觀察細胞及軸突的生長變化，故常用于神經元保護、軸突生長和突觸連接等方面的研究［9-10］。氧糖剝奪是在細胞水平上模擬缺血/低氧的刺激模型。通過對細胞培養條件的改變，包括將細胞放入低氧箱加之更換無糖的培養基，模擬細胞在缺血/低氧情況下的損傷，細胞會產生壞死、凋亡、自噬等現象。缺血性卒中是供應大腦的大動脈栓塞，而大腦主要動脈的閉塞會引發下游微血管的繼發血栓形成［11-12］，這些血栓會導致相應血管血流不暢、灌注不足，氧糖量減少。氧糖剝奪模擬體內腦缺血過程，而其治療的關鍵是時間窗內溶栓、取栓恢復血液的再灌注，但是再灌注會致使原缺血腦組織發生繼發性損傷。如神經細胞凋亡增加、活性氧產生增加，產生喪失機能、加速老化、免疫機能衰退的嚴重后果，以上稱為腦缺血再灌注損傷，復氧復糖則模擬再灌注的過程。所以氧糖剝奪/復氧復糖模型常用于腦卒中缺血再灌注的離體實驗。2021年8月—2022年6月，本研究通過建立氧糖剝奪/復氧復糖損傷SH-SY5Y 細胞模型，觀察梓醇對模型細胞是否有修復作用，并探討了其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑及儀器 SH-SY5Y 細胞由中國科學院干細胞庫提供。梓醇（純度≥97%，貨號：A0215，成都曼思特生物科技有限公司）。實驗試劑：CCK-8 試劑盒（貨號：KGP902，凱基生物）；0.25%Trypsin-EDTA（貨號：25200056，美國Gibco 公司）；MEM/F12 完全培養基（貨號：ZQ-1205，上海中喬新舟生物科技有限公司）；ATRA（美國Sigma 公司）；兔源抗IGF1（貨號：182408，英國Abcam 公司）、兔源抗GAP43（貨號：DF7766，中國 Affinity 公司）、兔源抗p-S6、β-Ⅲ-tubulin、IGFR、P-IGFR（貨號分別為4857、5568、9750、3024，美國CST 公司）、小鼠源抗NeuN、mTOR、GAPDH、兔源抗OPN、PTEN、羊抗小鼠二抗、CoraLite594 抗小鼠二抗、CoraLite488 抗兔二抗（貨號分別為66836、66888、60004、22952、22034、SA00013-7、SA00013-2，中國 Proteintech 公司）、羊抗兔二抗（BOSTER）。實驗儀器：三氣培養箱（美國Nuaire 公司）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）、熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）、激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss 公司）、金屬水浴鍋（德國GFL 公司）、低溫離心機（美國Thermo 公司）、化學發光儀（美國BIO-RAD 公司）、酶標儀（美國BIOTEK 儀器有限公司）。

1.2 SH-SY5Y 細胞的分組、氧糖剝奪/復氧復糖細胞損傷模型的建立、梓醇的加入 將SH-SY5Y 細胞分為梓醇組、模型組、誘導組、對照組。對照組：SHSY5Y細胞不做任何處理；誘導組：用ATRA誘導SHSY5Y 細胞72 h，將其誘導為成熟神經元；模型組：ATRA 誘導72 h 后，將完全培養基換成無糖的EBSS溶液置于三氣培養箱（氧氣1%，二氧化碳5%，氮氣94%）4 h，氧糖剝奪結束后換回完全培養基，復氧12 h；梓醇組：細胞經模型組同樣處理后，加入含不同濃度梓醇（50、100、200 μmol/L）的完全培養基常規培養72 h。經ATRA 誘導SH-SY5Y 分化3 d后，出現顯著的形態學改變，表現為神經元的特點，突起充分伸展，維持較長的長度。SH-SY5Y 經NeuN（神經元的特異核蛋白）、β-Ⅲ-tubulin（神經元的結構蛋白）抗體染色，陽性率達95%以上。提示在ATRA 誘導下，SH-SY5Y 可成功分化為成熟神經元細胞（圖1）。

SH-SY5Y 經ATRA 誘導后經氧糖剝奪/復氧復糖0、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h后，細胞的存活率分別為100%、87.25% ± 7.27%、67.50% ± 3.11%、70.25% ± 4.50%、64.50% ± 3.42%、58.00% ±6.48%、45.50% ± 1.29%、41.50% ± 3.00%，細胞的存活率呈時間依賴性遞減，細胞在4 h 達到58%（P＜0.0001），此時既對細胞造成一定的損傷，又保證大部分的細胞存活，符合后期給藥觀察的條件，所以確定4 h為后期實驗的最佳造模時間。

1.3 細胞活力的檢測 采用CCK-8 法。取上述各組對數生長期的神經細胞SH-SY5Y 以1×104/mL 接種于96 孔板，100 μL/孔，待細胞貼壁后，培養結束后，在每孔加入10 μL CCK-8 溶液與100 μL 完全培養基的混合液，置于37 ℃恒溫箱繼續培養3 h，反應結束后，使用酶標儀于490 nm 波長處測量吸光度值。

1.4 細胞遷移、穿越能力的觀察 采用細胞劃痕實驗。取模型組及梓醇組細胞，待細胞匯合度達到80%～90%后，用無菌的100 μm 槍頭沿直尺在皿底進行劃痕，PBS 清洗1 遍后，分別于處理后0 、48 h 在顯微鏡下拍照。以劃痕兩個邊緣為界，使用Image J 軟件測量兩個邊緣之間的面積，取均值。

注：圖A 為ATRA 誘導3 d 后SH-SY5Y 細胞的形態；圖B 為ATRA 誘導3 d 后采用β-III-tubulin、NeuN 進行免疫熒光染色的SH-SY5Y 細胞（熒光倒置顯微鏡，×200）。

1.5 細胞軸突長度的測算 采用免疫熒光染色法。將對照組、ATRA 誘導組、模型組、梓醇組細胞接種于共聚焦小皿，培養結束后，免疫熒光固定液固定細胞20 min，PBST 浸洗，加入山羊血清封閉60 min，去除血清封閉液，利用β-Ⅲ-tubulin、NeuN抗體進行免疫熒光染色，于4 ℃孵育過夜。用PBST洗凈一抗后，同時加入CoraLite594 抗小鼠、CoraLite488抗兔二抗稀釋液常溫避光孵育1 h，用PBST洗凈二抗后，加入含DAPI 的抗免疫熒光淬滅液，等待5 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并收集圖像，并使用Image J測量軸突長度，取均值。

1.6 細胞中GAP43、OPN、p-IGFR、PTEN、mTOR、p-S6蛋白的檢測 采用Western blotting 法。收集誘導組、模型組、梓醇組細胞，用含苯甲基磺酰氟（PMSF）和蛋白酶抑制的RIPA 裂解液提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳條件：80 V、30 min，120 V、60 min。轉膜條件：250 mA 恒流電轉90 min，在冰上完成，使用脫脂奶粉常溫封閉1 h。封閉結束后，加入稀釋后的GAP43、OPN、p-IGFR、PTEN、mTOR、p-S6、GAPDH、β-actin 一抗4 ℃孵育過夜。洗凈一抗，加入二抗，常溫孵育2 h。洗凈二抗，最后用超敏ECL 發光液顯影，使用Image J 軟件進行圖像分析。結果以各目的蛋白與內參蛋白相對表達量的比值來表示。

1.7 統計學方法 采用 SPSS26.0、Graphpad Prism 9 軟件。正態分布分析采用Kolmogorovsmirnov 檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組SH-SY5Y 細胞存活率比較 梓醇50 μmol/L 組、梓醇100 μmol/L 組、梓醇200 μmol/L組、模型組、誘導組、對照組SH-SY5Y 細胞存活率分別為74.10% ± 6.40%、68.50% ± 6.39%、69.9% ±1.37%、51.47% ± 6.98%、107.66% ± 6.15%、100%。與對照組相比，誘導組存活率升高（t=12.36，P＜0.0001）；與誘導組相比，模型組存活率降低（t=10.45，P＜0.0001）；不同濃度梓醇組存活率均有升高（t值分別為4.136、3.113、4.496，P均＜0.05），各濃度組之間的差異不具有統計學意義。

2.2 各組SH-SY5Y 細胞形態及軸突長度比較 經β-Ⅲ-tubulin 免疫熒光染色后，對照組細胞體圓潤，軸突較短，胞體與胞體之間幾乎沒有軸突連接。誘導組細胞軸突較長并且相互交織，形成神經網絡；與誘導組細胞相比，模型組細胞數量減少，胞體扁平，軸突回縮；與模型組比較，梓醇組神經元數量增多，軸突長度獲得一定的恢復。梓醇50 μmol/L 組、梓醇100 μmol/L 組、梓醇200 μmol/L 組、模型組、誘導組、對照組軸突長度分別為（93.78 ± 8.66）、（91.22 ± 10.97）、（88.77 ± 8.68）、（42.99 ± 5.72）、（110.97 ± 9.8）、（39.71 ± 5.73）μm，與對照組相比，誘導組軸突長度延長；與誘導組相比，模型組軸突長度縮短（t=21.59，P＜0.001）；不同濃度梓醇組神經元軸突長度均延長（t分別為16.97、13.68、13.18，P均＜0.01），而不同濃度梓醇組之間比較，P＞0.05。

2.3 梓醇組、模型組SH-SY5Y 細胞遷移、軸突穿越能力觀察 48 h 后，梓醇50 μmol/L 組、梓醇100 μmol/L 組、梓醇200 μmol/L 組、模型組細胞劃痕面積分別為（275.56 ± 16.98）、（311.16 ± 3.87）、（237.12 ± 10.85）、（343.74 ± 11.18）μm2。與模型組相比，不同濃度梓醇組48 h 后的劃痕面積均?。╰分別為4.742、3.892、9.674，P均＜0.05），不同濃度梓醇組之間比較，P＞0.05。

2.4 各組SH-SY5Y 細胞中GAP43、OPN、p-IGFR、PTEN、mTOR、p-S6蛋白相對表達量比較 與誘導組比較，模型組PTEN 相對表達量升高（P＜0.05），OPN降低（P＜0.05）；與模型組比較，不同濃度梓醇組GAP43、OPN、p-IGFR、mTOR 及其下游效應分子p-S6 蛋白相對表達量均升高，PTEN 蛋白相對表達量降低（P均＜0.05），詳見表1。

表1 各組GAP43、OPN、p-IGFR、PTEN、mTOR、p-S6蛋白相對表達量比較（±s）

表1 各組GAP43、OPN、p-IGFR、PTEN、mTOR、p-S6蛋白相對表達量比較（±s）

注：與誘導組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別梓醇50 μmol/L 組梓醇100 μmol/L組梓醇200 μmol/L組模型組誘導組p-S6 2.26 ± 0.30**3.25 ± 0.26**3.70 ± 0.31**0.61 ± 0.14 1 GAP43 1.36 ± 0.01**1.18 ± 0.08*1.05 ± 0.03 0.94 ± 0.10 1 OPN 0.80 ± 0.01*1.03 ± 0.04**1.23 ± 0.06**0.64 ± 0.01##1 p-IGFR 1.81 ± 0.05 2.04 ± 0.08*2.07 ± 0.03*1.75 ± 0.02 1 PTEN 0.70 ± 0.03*0.73 ± 0.12*0.49 ± 0.08*1.24 ± 0.10#1 mTOR 1.65 ± 0.23**1.26 ± 0.13*1.21 ± 0.19*0.82 ± 0.03 1

3 討論

缺血性腦卒中發病原因主要在于動脈粥樣硬化閉塞或血栓形成造成大腦區域供血不足，導致不可逆性的神經元損傷和死亡，致使患者出現多種神經功能缺損癥狀，嚴重影響患者的生活質量［13］。在神經功能恢復過程中，代償性軸突再生發芽、側支形成、新突觸形成及神經網絡再連接發揮著至關重要的作用。因此，通過增強神經再生重塑能力改善神經功能缺損癥狀，是缺血性腦卒中的重要治療策略［14-15］。

中藥地黃因較好的臨床療效被廣泛應用于神經系統疾病中，在缺血性腦卒中治療的常用中藥方中，如地黃飲子、羚羊角湯、左歸丸等都有地黃［16］，尤其既病之后“髓海不足”導致偏癱等后遺癥纏綿難愈，地黃填精益髓的功效發揮著尤為重要的作用［17］。梓醇是從地黃中提取的一種環烯醚萜類化合物，為地黃的主要化學成分［18］。越來越多的研究表明梓醇是治療腦缺血［19-20］、糖尿病腦?。?1］和癡呆等老年神經退行性疾病的潛在藥物，但梓醇作用的靶點和機制尚不明確，仍需進一步研究和探索。

mTOR 是調控神經細胞內在生長能力的關鍵信號通路，其下游蛋白p-S6 磷酸化表達水平可間接表征mTOR 活性，mTOR/p-S6 活性的增強與缺血性腦損傷后軸突再生能力密切相關。研究表明，梓醇能通過調控mTOR 信號通路來促進大鼠軸突生長和皮質脊髓束芽生重塑，促進坐骨神經損傷修復，縮小梗死中心范圍，并促進梗死周邊血管新生。PTEN 是抑制細胞內在生長能力的重要分子靶點，成年后高水平的PTEN 能夠抑制mTOR 通路，使成熟神經元軸突芽生和再生能力顯著下降。研究［22-23］表明，抑制PTEN 表達，重新激活mTOR 通路，能夠促進視神經軸突和脊髓損傷后皮質脊髓束軸突的顯著芽生、再生以及功能恢復。新近的研究［24］也提示，mTOR 通路相關蛋白OPN 在神經再生修復過程中發揮重要作用，通過OPN 和IGF1聯合應用，可實現視神經軸突的顯著芽生和長距離再生，促進視覺功能恢復。本課題組前期研究也發現，OPN 可激活mTOR 通路激發神經細胞內在生長能力，促使皮質脊髓束軸突發芽和側支形成，促進運動功能恢復［25］。進一步的機制研究表明，OPN 能夠聚集、調動細胞表面IGFR 受體，并誘導其磷酸化成為p-IGFR，進而激活mTOR 通路，同時降低PTEN 表達，以減輕其對mTOR 通路的抑制作用，使細胞內在生長能力被充分調動，細胞活力、遷移能力顯著增強，從而達到促進軸突發芽和生長作用的。

本研究使用ATRA將未分化的SH-SY5Y細胞誘導分化為成熟的神經元細胞，此時軸突相對較長，便于后續實驗觀察，并使用神經元特異性標志蛋白NeuN 進行鑒定，氧糖剝奪/復氧復糖模擬體內腦缺血再灌注的過程，氧糖剝奪4 h、復氧復糖24 h，細胞死亡率達40%左右。研究證實梓醇可顯著增強經氧糖剝奪/復氧復糖損傷后的SH-SY5Y 細胞活力，促進軸突生長，并提高其遷移、穿越能力。進一步的機制研究顯示，梓醇可顯著促進OPN、p-IGFR、mTOR 及其下游效應分子p-S6 蛋白的表達，并抑制負性調控因子PTEN 蛋白的表達水平，提示梓醇可能通過調控OPN/p-IGFR/mTOR 信號軸參與對神經細胞內在生長能力的調控，細胞活力、遷移能力顯著增強，提高健側神經元向病灶側遷移，健側軸突生長至患側，形成新的神經網絡連接，縮小半暗帶的面積進而發揮其對缺血缺氧條件下病灶神經元再生修復的促進作用，本研究結果還顯示，加入50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 梓醇對SHSY5Y 細胞的活力，遷移、穿越能力及促進軸突的生長能力相當，三者之間的比較無統計學差異，從效價方面考慮，將采用50 μmol/L 梓醇進行后續相關細胞實驗。

綜上所述，梓醇可能通過OPN/p-IGFR/mTOR 信號軸，增強氧糖剝奪/復氧復糖損傷后SH-SY5Y 細胞的活力，提高其遷移、穿越能力，并促進軸突的生長，進而發揮其對缺血缺氧條件下神經元的保護，神經細胞的遷移及軸突再生修復作用。