喬松素對缺氧/復氧誘導大鼠心肌細胞焦亡的預防作用及其機制

張威，盧小偉，許浩

湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院心血管內科，湖北十堰 442008

心血管疾病是全球病死率最高的疾病，占世界總死亡率的1/3，急性心肌梗死（AMI）是其中較為嚴重的一種心血管系統疾?。?］。臨床治療AMI的常用方法為再灌注，以此來改善心肌缺血的癥狀［2］。但心肌缺血改善后，可能會出現心肌缺血再灌注損傷（MIRI），表現為心肌組織損傷或心功能異常。MIRI的發作機制主要與氧化應激、炎癥、鈣超載、細胞因子釋放與中性粒細胞浸潤等密切相關［3］。細胞焦亡是一種新型的細胞程序性死亡形式，但其對炎癥具有促進作用，并與NLRP3的激活相關。研究［4］表明，細胞焦亡與MIRI有一定關系。喬松素（PIN）是從某些植物、蜂膠或蜂蜜中提取出來的黃酮類化合物，藥理學研究顯示PIN 具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和神經保護等作用。研究［5］發現，PIN能夠使大鼠主動脈平滑肌細胞引起的血管收縮能力減弱，發揮舒張血管的作用。也有證據顯示PIN 能改善缺血性心力衰竭大鼠的心律失常［6］。但是PIN 能否抑制缺氧/復氧（H/R）誘導的心肌細胞焦亡，目前還未明確。PI3K/AKT/NF-κB 是涉及炎癥的一種常見信號通路，LIU等［7］發現，葵潔元湯通過影響TLR4依賴性PI3K/AKT/NF-κB 氧化和炎癥信號及腸道微生物改善潰瘍性結腸炎的腸屏障損傷，但是該通路在H/R誘導的心肌細胞焦亡中的機制還尚不明確。2022年7月—2022年9月，本研究通過觀察預先加入PIN的大鼠心肌細胞H9c2 H/R 處理后的細胞活力、細胞焦亡情況、LDH 水平、細胞焦亡相關蛋白相對表達量變化，以探討PIN 對H/R 誘導的大鼠心肌細胞焦亡的預防作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 大鼠心肌細胞H9c2由中國科學院上海細胞庫提供。大鼠心肌細胞H9c2 培養在含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基中，在溫度37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，每2～3 天更換一次培養基。待細胞生長至80%左右進行傳代，傳代3 次后的對數生長期細胞用于實驗。喬松素（＞99%）購自于武漢科斯坦生物科技有限公司；高糖DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司（美國）；青霉素-鏈霉素混合液、CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PI、Hoechst 33342、BCA 蛋白定量試劑盒、PI3K、AKT、NF-κB、p-PI3K、p-AKT、p-NF-κB p65、Caspase-1、ASC、NLRP3 一抗及其相應二抗購自Sigma 公司（美國）；PI3K 激活劑740-Y-P 購自Selleck 公司。儀器：全自動酶標儀（F.A.M.E.16/20 型）購自瑞士哈美頓公司；全自動化學發光凝膠成像系統購自美國Bio-Rad 公司；熒光顯微鏡購自德國Leica 公司；熒光定量PCR儀購自北京安諾倫生物科技有限公司。

1.2 H9c2 細胞分組、PIN 的加入、H/R 處理、將H9c2 細胞隨機分為PIN-H + 740-Y-P 組（25 μmol/L PIN + 50 μg/mL 740-Y-P［8］）、PIN-H 組（25 μmol/L PIN［9］）、PIN-L 組（12.5 μmol/L PIN）、模型組、對照組。對照組細胞的培養條件如1.1所述。其余各組細胞加入相應濃度的藥物共同孵育1 h，之后進行H/R處理。根據參考文獻［10］，首先對細胞培養基進行處理。取無糖無血清的DMEM 培養基，將其置于37 ℃的低氧培養箱中，混合通入流速為2 L/min的95%N2和5%CO2氣體3 h。之后將H9c2細胞原有的培養基迅速換成上述處理好的DMEM 培養基，并放在低氧培養箱中繼續培養12 h。之后重新將培養基置換為含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，在溫度37 ℃、CO2體積分數5%的細胞培養箱中繼續培養4 h。

1.3 H9c2 細胞的活力檢測 采用CCK-8 法。將1.2 所述的各組細胞繼續培養24 h、48 h、72 h 后每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，繼續培養2 h 后，在酶標儀450 nm下測定每孔的吸光度（OD450值）。

1.4 各組焦亡心肌細胞的比例測算 采用PI 染色法。將1.2 所述的各組細胞的培養基棄去，加入細胞染色緩沖液0.1 mL，加入Hoechst 染色液和PI 染色液各5 μL，輕輕晃勻，在4 ℃環境下避光孵育0.5 h。孵育結束后用PBS 洗滌，在熒光顯微鏡下觀察細胞染色結果。Hoechst 染色結果陽性細胞呈藍色，PI 染色陽性細胞呈紅色。PI 陽性表示細胞出現焦亡。結果用PI陽性細胞比例表示。

1.5 各組H9c2 細胞中LDH 檢測 采用ELISA 法。將1.2 所述的各組細胞繼續培養24 h 后，離心后取上清液。按照LDH試劑盒的說明書操作，測定H9c2細胞中的LDH。

1.6 各組H9c2 細胞中PI3K/AKT/NF-κB 信號通路和細胞焦亡相關蛋白檢測 采用Western blotting 法檢測。取1.2 所述的各組細胞，加入RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，上樣后電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉。加入PI3K、AKT、NF-κB p65、p-PI3K、p-AKT、p-NF-κB p65、Caspase-1、NLRP3、ASC、β-actin 一抗孵育過夜（4 ℃）。次日加入相應二抗室溫下孵育1 h，進行顯色、拍照和蛋白條帶灰度值的測定。

1.7 各組H9c2 細胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA檢測 采用熒光定量PCR 法。取1.2所述的各組細胞，加入TRIzol 試劑提取細胞RNA，通過紫外分光光度法對RNA 進行定量測定。將RNA 逆轉錄為cDNA 后進行PCR 擴增。PCR 擴增條件為：94 ℃預變性5 min→94 ℃變性30 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s，共30 次循環。引物序列設計如下：PI3K上游引物：5′CATCACTTCCTCCTGCTCTAT3′，下游引物：5′CAGTTGGTTGGCAATCTTCTTC3′；AKT 上游引物：5′AAACCTGGCGGCCACGCTAC3′，下游引物：5′TTGGCCAGGGCCACCTCCAT3′；NF-κB 上游引物：5′CAAGATCTGCCGAGTAAACC3′，下游引物：5′TCGGAACACAATGGCCACTT3′；β-actin 上游引物：5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′，下游引物：5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3′。以β-actin 為內參，使用2-ΔΔCt方法計算PI3K、AKT 和NF-κB mRNA的相對表達量。

1.8 統計學方法 采用GraphPad 7.0 軟件。正態分布檢驗采用Shapiro-Wilk 法，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組H9c2 細胞活力比較 與對照組相比，模型組細胞OD450值（48 h、72 h）降低（P均＜0.05）；與模型組相比，PIN-H 組細胞OD450值（48 h、72 h）升高（P均＜0.05）；與PIN-L組相比，PIN-H組細胞OD450值（48 h、72 h）升高（P均＜0.05）；與PIN-H 組相比，PIN-H + 740-Y-P 組細胞OD450值（48 h、72 h）降低（P均＜0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠H9c2細胞活力比較（±s）

表1 各組大鼠H9c2細胞活力比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PIN-L組比較，^P＜0.05；與PIN-H組組比較，&P＜0.05。

組別OD450值72 h 0.57 ± 0.05^0.71 ± 0.05#&0.52 ± 0.06 0.47 ± 0.04*0.84 ± 0.07 PIN-H + 740-Y-P組PIN-H組PIN-L組模型組對照組24 h 0.30 ± 0.03 0.28 ± 0.04 0.26 ± 0.03 0.24 ± 0.02 0.27 ± 0.03 48 h 0.38 ± 0.03^0.54 ± 0.04#&0.40 ± 0.05 0.35 ± 0.04*0.62 ± 0.05

2.2 各組PI 陽性心肌細胞比例、LDH 水平、細胞焦亡相關蛋白相對表達量比較 與對照組相比，模型組PI 陽性心肌細胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC和NLRP3蛋白相對表達量升高（P均＜0.05）；與模型組相比，PIN-H 組PI 陽性心肌細胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC 和NLRP3 蛋白相對表達量降低（P均＜0.05）；與PIN-L 組相比，PIN-H 組PI 陽性心肌細胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC 和NLRP3 蛋白相對表達量降低（P均＜0.05）；與PIN-H 組相比，PIN-H+ 740-Y-P 組PI 陽性心肌細胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC 和NLRP3 蛋白相對表達量升高（P均＜0.05），詳見表2。

表2 各組PI陽性心肌細胞比例、LDH水平及細胞焦亡相關蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組PI陽性心肌細胞比例、LDH水平及細胞焦亡相關蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PIN-L組比較，^P＜0.05；與PIN-H組組比較，&P＜0.05。

組別PIN-H + 740-Y-P組PIN-H組PIN-L組模型組對照組NLRP3 0.56 ± 0.06^0.41 ± 0.05#&0.62 ± 0.08 0.65 ± 0.06*0.36 ± 0.04 PI陽性心肌細胞比例（%）47.20 ± 5.06^31.42 ± 4.55#&50.48 ± 8.21 59.23 ± 6.16*5.47 ± 0.94 LDH（U/L）114.83 ± 8.23^71.46 ± 6.50#&130.54 ± 15.49 143.63 ± 10.91*23.48 ± 2.04 Caspase-1 0.56 ± 0.05^0.44 ± 0.05#&0.63 ± 0.08 0.69 ± 0.06*0.33 ± 0.04 ASC 0.47 ± 0.05^0.38 ± 0.04#&0.51 ± 0.07 0.54 ± 0.05*0.24 ± 0.03

2.3 各組細胞中PI3K/AKT/NF-κB 信號通路相關蛋白及PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 表達的比較 與對照組相比，模型組細胞中PI3K、AKT 和NFκB mRNA 相對表達量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平升高（P均＜0.05）；與模型組比較，PIN-H 組細胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 相對表達量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平降低（P＜0.05）；與PIN-L 組相比，PIN-H 組細胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 相對表達量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平降低（P＜0.05）；與PIN-H 組相比，PIN-H + 740-Y-P 組細胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 相對表達量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平升高（P均＜0.05），詳見表3。

表3 各組細胞中PI3K、AKT和NF-κB mRNA相對表達量及PI3K、AKT和NF-κB p65蛋白磷酸化水平比較（±s）

表3 各組細胞中PI3K、AKT和NF-κB mRNA相對表達量及PI3K、AKT和NF-κB p65蛋白磷酸化水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PIN-L組比較，^P＜0.05；與PIN-H組比較，&P＜0.05。

組別PIN-H + 740-Y-P組PIN-H組PIN-L組模型組對照組p-NF-κB p65/NFκB p65 0.64 ± 0.07^0.51 ± 0.05#&0.72 ± 0.09 0.76 ± 0.08*0.40 ± 0.05 PI3K mRNA 1.69 ± 0.02^1.32 ± 0.01#&1.83 ± 0.04 1.86 ± 0.02*1.00 ± 0.00 AKT mRNA 1.66 ± 0.03^1.46 ± 0.02#&1.74 ± 0.05 1.78 ± 0.02*1.00 ± 0.00 NF-κB mRNA 1.52 ± 0.02^1.37 ± 0.03#&1.61 ± 0.05 1.65 ± 0.04*1.00 ± 0.00 p-PI3K/PI3K 0.70 ± 0.07^0.54 ± 0.05#&0.78 ± 0.08 0.81 ± 0.06*0.44 ± 0.05 p-Akt/Akt 0.77 ± 0.08^0.59 ± 0.06#&0.81 ± 0.10 0.85 ± 0.09*0.56 ± 0.06

3 討論

MIRI 是心血管疾病中常見的組織損傷，它是缺血的心肌組織灌注血液后出現心率失常、心肌能量代謝障礙、甚至出現梗死面積擴大等不良現象［11］。目前針對MIRI 并無特效藥，其嚴重影響了AMI 的治療效果，為臨床治療帶來阻礙和困難。H9c2 細胞能完整復制成年大鼠的心肌細胞形態學和電生理學等生理學特征，且H9c2 的H/R 損傷能與人體心肌細胞MIRI 的病理學特征與機制契合。如今使用H9c2 細胞構建大鼠心肌細胞H/R 模型已被廣泛熟知與應用［12-13］。有證據表明當H/R 發生時，心肌細胞膜通透性增加，心肌中LDH 大量釋放入血，使血清中LDH 水平升高［14］。本研究結果顯示，模型組H9c2 細胞活力下降；細胞焦亡比例、LDH 水平升高，說明大鼠心肌細胞H/R 模型建立成功。

細胞焦亡是一種促炎性、程序性的細胞死亡方式。細菌、病毒、毒素或化療藥物等作為細胞損傷的誘因，通過Caspase-1 蛋白介導細胞焦亡的發生。當細胞焦亡發生時，細胞質膜破裂，內容物流出，促炎因子釋放［15-16］。細胞焦亡在神經系統疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病如心肌MIRI 和腫瘤的發生發展中起著重要的作用［17-18］。研究［19］發現，MIRI 發生時細胞焦亡引起的炎癥損傷會使病情加重，抑制細胞焦亡可以有效減輕MIRI 的心肌損傷。BIAN 等［20］研究發現，與對照組相比，模型組小鼠心肌梗死面積和LDH水平增加，焦亡相關蛋白GSDMD-NT 和Caspase-1水平增加。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組心肌細胞焦亡比例，血清LDH 水平，細胞焦亡相關蛋白Caspase-1、ASC 和NLRP3 的表達升高，與文獻報道相一致。說明心肌細胞的H/R 模型造模成功。

PIN 存在于多種植物、蜂膠中，這種黃酮類單體化合物對很多疾病均有治療作用。TAO 等［21］研究發現，PIN 能保護缺血/再灌注引起的腦損傷，機制可能與細胞自噬有關。艾世鵬等［22］研究發現，PIN能夠保護腸缺血/再灌注的腸黏膜損傷，這種作用可能與其抗炎、抗氧化和抑制p38 MAPK 信號通路活性有關。于飛等［23］研究發現，PIN 能減輕內質網應激引起的人臍靜脈內皮細胞的凋亡，其機制可能與抑制ATF6/PERKCHOP 信號通路有關。這些結果都提示PIN可能通過發揮其抗炎作用來減輕H/R心肌細胞的損傷。本研究結果顯示，與模型組相比，PIN-H 組細胞活力（48 h、72 h）提高，心肌細胞焦亡比例，LDH 水平，焦亡相關蛋白Caspase-1、ASC 和NLRP3 表達降低，說明PIN 能預防H/R 誘導的心肌細胞焦亡。

PI3K/AKT/NF-κB 信號通路是調節細胞生長、凋亡和血管生成的重要信號通路之一，它能減輕炎癥和損傷［24］。越來越多研究者發現，PI3K/AKT/NF-κB 信號通路在調節H/R 中發揮重要作用。LUAN 等［25］發現，黃芩苷能通過調節PI3K/AKT，抑制NF-κB 信號傳導來減輕心肌H/R 損傷，減輕炎癥和抑制凋亡。DONG 等［26］研究發現，囊性纖維化跨膜電導調節劑的過表達能保護人克隆結腸腺癌細胞免受H/R 誘導的細胞凋亡，可能是通過調節PI3K/AKT/NF-κB 信號通路實現的。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組心肌細胞PI3K、Akt 和NFκB mRNA 相對表達量，PI3K、Akt、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平上升；與模型組相比，PIN-H 組心肌細胞PI3K、Akt 和NF-κB mRNA 相對表達量，PI3K、Akt、NF-κB p65 蛋白的磷酸化水平下降。這些結果說明PIN 可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB 信號通路，抑制H/R 誘導的心肌細胞焦亡。為了驗證此猜想，我們用PI3K 激活劑740-Y-P 來干預高濃度的PIN 組，結果發現740-Y-P 減弱了PIN 對心肌細胞焦亡的抑制作用。

綜上所述，PIN可能通過下調PI3K/AKT/NF-κB信號通路，預防H/R 誘導的心肌細胞焦亡。該研究為MIRI 臨床治療方法及其機制提供了新的思路。但本研究是在細胞水平上進行的研究，為探索其在體內作用的影響與機制，還需進一步設計相關動物試驗及臨床試驗。