失笑散“異病同治”原發(fā)性痛經(jīng)和慢性萎縮性胃炎的作用機制預測及動物試驗驗證

毛金花，耿楠，路遙，馬子坤，張省委，韓冉

1 北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，北京100029；2 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院

原發(fā)性痛經(jīng)（PD）主要指骨盆內(nèi)臟器沒有出現(xiàn)器質(zhì)性病變的痛經(jīng)，其臨床表現(xiàn)主要為行經(jīng)前后及經(jīng)期出現(xiàn)腹痛，并伴有惡心嘔吐、頭暈頭痛、腰痛等癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［1-2］。中醫(yī)屬于“婦人腹痛”“經(jīng)行頭痛”等范疇。慢性萎縮性胃炎（CAG）是指胃黏膜上皮遭受反復損害導致固有腺體萎縮，伴或不伴有腸化生和異型增生的一種慢性胃部疾病［3］。臨床表現(xiàn)常為胃痛痞滿、噯氣泛酸、食欲減退等，中醫(yī)學屬“胃脘痛”“胃痞”等范疇。失笑散出自宋代陳師文等撰寫的《太平惠民和劑局方》，其由五靈脂和蒲黃組成，有活血化瘀、散結(jié)定痛之功。此方配伍巧妙，目前臨床應用于治療多種疾病，如PD、子宮內(nèi)膜異位癥、CAG、冠心病等［4-6］，療效顯著。但目前失笑散治療PD 和CAG 的作用機制仍不明確。2022年4—12月，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學預測失笑散治療PD 和CAG 的作用機制，為中醫(yī)“異病同治”提供理論依據(jù)；同時對失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)的機制進行動物體內(nèi)實驗驗證。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源、實驗動物、試劑及儀器 藥物靶點數(shù)據(jù)庫：TCMSP、BATMAN-TCM；疾病靶點數(shù)據(jù)庫：GeneCards、DrugBank、OMIM。SPF 級SD 雌性未孕大鼠60 只，5 周齡，體質(zhì)量190～220 g［北京維通利華生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0006］。動物在北京中醫(yī)藥大學附屬東方醫(yī)院實驗中心飼養(yǎng)、開展實驗，溫度19～21 ℃，濕度50%左右。本實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（DF2022-19-04）。試劑：失笑散（炒蒲黃、五靈脂各15 g；各組方加水煎煮2 次，第1 次1.5 h，第2 次0.5 h，2 次藥液混合后濃縮成1 g/mL的生藥煎劑；上述中藥均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院鑒定，符合國家藥品標準規(guī)定）；布洛芬片（2019020303，0.1 g/片，河北恒利集團制藥股份有限公司） ；苯甲酸雌二醇注射液（批號：120207，寧波市三生藥業(yè)有限公司）；縮宮素注射液（批號：120302，上海禾豐制藥廠）；戊巴比妥鈉（批號：T20080530，金木水火土科技有限公司）。大鼠TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），大鼠VEGFA、PTGS2 ELISA 試劑盒（英國ABCAM 公司）。儀器：AXTGL16M 離心機（恒諾儀器）、ELX800 型酶標儀（美國Bio Tex 公司）、電子天平、移液槍。

1.2 失笑散治療PD、CAG作用機制的預測方法

1.2.1 失笑散的活性成分及作用靶點篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取失笑散中“蒲黃”的活性成分，規(guī)定口服生物利用度（OB）≥30% 及類藥性（DL）≥0.18［7-8］，獲取對應中藥的活性成分及對應靶點；通過BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫獲取失笑散中“五靈脂”的活性成分，規(guī)定Score cutoff≥30 及P≤0.05。UniProt數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點蛋白的基因名，獲取失笑散的活性成分和作用靶點。

1.2.2 失笑散作用靶點與PD、CAG 疾病靶點的交集靶點獲取 以“primary dysmenorrhea”“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞在GeneCards、DrugBank及OMIM數(shù)據(jù)庫中分別進行檢索，得到PD與CAG疾病靶點。將藥物靶點與疾病靶點取交集。

1.2.3 失笑散治療PD 和CAG 的核心活性成分、核心靶點獲取 利用Cytoscaape3.9.1 軟件構(gòu)建交集靶點—活性成分—藥物—疾病網(wǎng)絡(luò)圖。利用Network Analyzer 來計算網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵節(jié)點度值（Degree）及介數(shù)中心性（BC）。依據(jù)節(jié)點度值，由大到小篩選出度值排名前五的核心活性成分。利用STRING 數(shù)據(jù)庫，輸入上述交集靶點，物種限定為人，選擇置信度分值＞0.40，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖。利用Cytoscape 軟件對PPI 結(jié)果進行可視化處理。依據(jù)節(jié)點度值，由大到小篩選出度值排名前五的核心靶點。

1.2.4 核心靶點的生物信息學分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO 功能富集與KEGG 功能富集分析，P＜0.05 為篩選條件，預測失笑散治療PD、CAG 的作用機制。按P值由小到大排序，選擇前10條GO各分類功能富集結(jié)果和前20條KEGG通路。

1.2.5 失笑散核心活性成分與核心靶點分子對接 將度值排名前5 的核心靶點和核心藥物活性成分經(jīng)過AutoDockTools-1.5.6 軟件進行分子對接，統(tǒng)計各個組合的打分。結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol 表示兩者之間結(jié)合活性較好；＜-7.0 kcal/mol表示兩者之間結(jié)合活性強烈［9-10］。利用PyMOL 軟件將對接結(jié)果可視化，同時繪制出“蛋白—分子”對接作用模式圖。

1.3 失笑散治療PD、CAG 作用機制的動物實驗驗證方法

1.3.1 大鼠分組、PD 模型建立與失笑散灌胃給藥 大鼠以普通固體飼料、自來水適應性喂養(yǎng)5 d后，隨機分為失笑散低、中、高劑量組（2.5 g/kg，5 g/kg，10 g/kg）［11］，模型組，陽性對照組（布洛芬20 mg/kg）［12］及陰性對照組，每組各10 只。除外陰性對照組，其余各組均參考相關(guān)文獻［13］建立PD 動物模型，大鼠均股部皮下注射苯甲酸雌二醇10 d，每天1 次，第1、10 天皮下注射1.2 mL/kg，第2 至9 天皮下注射0.5 mL/kg；陰性對照組皮下注射等量生理鹽水。造模過程中從第4 天各給藥組開始注射苯甲酸雌二醇后立即灌胃對應治療藥品，對照組大鼠灌胃等量生理鹽水，每天1 次。第11 天陰性對照組皮下注射生理鹽水1.0 mL/ kg，剩余各組大鼠腹腔注射縮宮素1.0 mL/kg。第12 天大鼠麻醉處死，取血液開展下一步實驗。若模型大鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干和后肢伸展等明顯扭體反應，說明造模成功［14］。

1.3.2 大鼠扭體反應次數(shù)、子宮收縮抑制率和子宮指數(shù)的測算 大鼠扭體反應的次數(shù)：在給藥前和末次給藥后1 h，按照10 mL/kg為大鼠腹腔注射0.6%醋酸，記錄大鼠20 min 內(nèi)出現(xiàn)扭體反應的次數(shù)。子宮收縮抑制率和子宮指數(shù)：檢測扭體反應后，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在下腹部的正中作5 cm 切口，將子宮取出，選左側(cè)子宮角長3 cm 的一段，然后將子宮角陰道端和卵巢端分別縫在塑料丫形支架上底的兩端，將子宮兩指點中間用一條棉線固定，棉線從塑料管引出連接到傳感器，各組大鼠尾靜脈注射0.025 U縮宮素，5 min后各組大鼠灌胃相應藥物，記錄在給藥后60 min 子宮平滑肌的活動，最后稱取子宮質(zhì)量，計算子宮收縮抑制率和子宮指數(shù)。子宮收縮抑制率（%）=（給予縮宮素后數(shù)值-給予縮宮素前數(shù)值）/給予縮宮素前數(shù)值×100%；子宮指數(shù)（%）=子宮濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.3.3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1 與子宮組織VEGFA、PTGS2 的檢測 采用ELISA 法。大鼠麻醉處死，取頸動脈血4 mL 及子宮組織，將子宮組織放置于-80 ℃冰箱凍存。將血液置于不加抗凝劑的離心管中，3 000 r/min離心10 min，將血清按照試劑盒說明書操作，測出各組血清TNF-α、IL-6、IL-1。各組取0.1 g 子宮組織進行稱重，摻入0.9 mL 生理鹽水，用組織勻漿器來勻漿，12 000 r/min離心10 min后取上清液，按照試劑盒上說明書進行操作，得到子宮組織中VEGFA和PTGS2的水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)采用Shapiro-Wick 方法行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 失笑散治療PD、CAG 作用機制的預測結(jié)果 ①失笑散活性成分、失笑散與疾病的交集靶點：失笑散活性成分15 個，其中蒲黃8 個，分別為黃杞苷、花生四烯酸、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、棕櫚酸睪酮、山奈酚-3-O-β-D-槐糖苷、槲皮素；五靈脂7個，分別為波那拉酮A、尿酸、五靈脂酸、4'-聯(lián)苯酚、續(xù)斷皂苷E1、尿素、三羥基異膽固醇酸。將失笑散2味中藥的靶點合并，保留惟一值，共218個靶點。在GeneCards、DrugBank 及OMIM 3個數(shù)據(jù)庫中獲得PD與CAG 相關(guān)靶點分別為712個、821個。將PD、CAG相關(guān)靶點與失笑散作用靶點取交集，得到35個交集靶點。②失笑散治療PD 和CAG 的核心有效成分、核心靶點：交集靶點—活性成分—藥物—疾病網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。其中包含53 個節(jié)點和167 條邊組成，分別為藥物節(jié)點1 個（V 形），成分節(jié)點15 個（圓角矩形），靶點基因節(jié)點35 個（橢圓形）及2 個疾病節(jié)點（菱形）。quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、arachidonic acid（花生四烯酸）、isorhamnetin（異鼠李素）等可能是失笑散治療PD 和CAG 的核心有效成分。PPI 圖見圖2。IL-6、TNF、TP53、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（VEGFA）、白介素1β（IL-1β）等是失笑散治療PD及CAG 的潛在核心靶點。③生物學功能：GO 分析結(jié)果共有442 個項目（BP：374，CC：21，MF，47），生物過程富集于基因表達的正、負向調(diào)節(jié)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、藥物反應等；細胞組成方面主要是在細胞溶質(zhì)、細胞核、細胞外空隙等；在分子功能上著重于酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶綁定等。KEGG 分析共獲得121 條通路，與內(nèi)分泌、代謝、癌癥等相關(guān)。④分子對接結(jié)果：對接后統(tǒng)計打分可知核心靶點和藥物核心有效成分平均結(jié)合能為-7.02 kcal/mol，分子對接的具體信息見表1。

表1 失笑散核心活性成分與核心靶點分子對接信息

圖1 失笑散治療PD與CAG的交集靶點—活性成分—藥物—疾病網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 交集靶點的PPI圖

2.2 失笑散治療PD、CAG 作用機制的驗證結(jié)果①各組大鼠的扭體反應次數(shù)、子宮收縮抑制率及子宮指數(shù)：與對照組比較，模型組大鼠扭體次數(shù)增多、子宮指數(shù)升高，子宮收縮抑制率降低；與模型組比較，失笑散低中高劑量組扭體次數(shù)降低、子宮指數(shù)降低，子宮收縮抑制率升高（P均＜0.05），詳見表2。②各組血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平及子宮組織PTGS2、VEGFA 水平比較：與對照組比較，模型組IL-1、IL-6及TNF-α 的水平上調(diào)（P均＜0.05）；與模型組比較，失笑散中高劑量組IL-1、IL-6 及TNF-α 水平均降低（P均＜0.05）；與對照組比較，模型組PD 大鼠子宮組織中PTGS2和VEGFA的水平升高（P均＜0.05），與模型組比較，失笑散中高劑量組PTGS2和VEGFA的水平降低（P均＜0.05），詳見表3。

表2 各組大鼠扭體反應、子宮收縮抑制率及子宮指數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠扭體反應、子宮收縮抑制率及子宮指數(shù)比較（±s）

組別n 子宮收縮抑制率（%）子宮指數(shù)（%）失笑散低劑量組失笑散中劑量組失笑散高劑量組模型組陽性對照組陰性對照組52.36 ± 5.52 39.77 ± 4.46 37.02 ± 3.85 66.64 ± 5.78 28.34 ± 3.41 25.63 ± 3.71 10 10 10 10 10 10扭體反應（次）給藥前33.53 ± 5.41 36.21 ± 5.94 37.71 ± 6.17 37.42 ± 5.32 38.27 ± 5.28 1.21 ± 0.63給藥后13.42 ± 1.63 11.76 ± 1.45 9.25 ± 0.64 31.26 ± 3.48 5.32 ± 0.73 1.29 ± 0.52 62.73 ± 10.33 75.45 ± 8.44 93.74 ± 7.53 0.17 ± 0.18 96.08 ± 6.83 96.87 ± 9.75

表3 各組血清中TNF-α、IL-6、IL-1水平及子宮組織中PTGS2、VEGFAS水平（±s）

表3 各組血清中TNF-α、IL-6、IL-1水平及子宮組織中PTGS2、VEGFAS水平（±s）

組別失笑散低劑量組失笑散中劑量組失笑散高劑量組模型組陽性對照組陰性對照組n 10 10 10 10 10 10 IL-1 （pg/mL）84.89 ± 29.66 65.43 ± 20.57 58.65 ± 18.97 103.44 ± 30.65 60.42 ± 20.27 42.02 ± 11.21 IL-6 （pg/mL）98.38 ± 20.22 80.81 ± 16.32 72.54 ± 17.88 114.36 ± 23.83 71.89 ± 18.54 58.21 ± 11.58 TNF-α（pg/mL）138.51 ± 30.38 97.33 ± 20.24 92.81 ± 19.81 166.56 ± 37.84 91.23 ± 21.31 88.33 ± 22.45 PTGS2（ng/L）422.21 ± 20.18 356.43 ± 20.07 363.22 ± 20.11 447.45 ± 34.73 362.75 ± 19.76 356.93 ± 16.88 VEGFA（ng/L）77.15 ± 8.24 68.76 ± 7.97 59.16 ± 8.72 80.21 ± 10.35 55.88 ± 8.19 58.02 ± 7.97

3 討論

失笑散中五靈脂、蒲黃等量配伍，釅醋煎煮，增其活血化瘀止痛之功。原方常用于治療婦科PD、產(chǎn)后腹痛、子宮內(nèi)膜異位癥等血瘀之證，現(xiàn)代也被廣泛應用于治療CAG、冠心病等多種疾病，體現(xiàn)了中醫(yī)的異病同治。PD 及CAG 西醫(yī)病因雖不相同，但中醫(yī)病機兩者都有“瘀”。

本研究運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出失笑散活性成分15 個，其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等可能是失笑散治療PD 及CAG 的核心成分。槲皮素通過抑制環(huán)氧合酶與脂氧合酶，進而減少致炎物質(zhì)的生成，從而緩解PD 的疼痛［15-16］；槲皮素可通過調(diào)節(jié)NLRP3 炎癥小體和抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達起到抗炎作用，抑制胃癌細胞的增殖和侵襲［17-18］。山奈酚主要通過調(diào)節(jié)促炎性因子的活性和炎癥相關(guān)的基因表達，抑制轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子等來發(fā)揮抗炎作用［19-20］。β-谷甾醇具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗腫瘤等作用［21］。CHOI 等［22］通過研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可抑制IL-6 的活性、減少炎性因子（TNF-α、IL-1β 等）的分泌及一氧化氮（NO）的產(chǎn)生來發(fā)揮抗炎作用。因此，推測失笑散的核心活性成分可能是通過抗炎機制來發(fā)揮治療PD 及CAG的作用。

PPI 分析發(fā)現(xiàn)，IL-6、TNF、TP53、VEGFA、IL-1β等是失笑散治療PD及CAG 的潛在核心靶點。IL-6、TNF 是常見的炎癥細胞因子，兩者水平過高可能會導致慢性炎癥疾病［23］。IL-6與相應受體結(jié)合后可促使細胞分化并產(chǎn)生較多免疫球蛋白，引起炎癥發(fā)生發(fā)展［24］。TNF 可刺激細胞增殖分化，同時抑制細胞的凋亡，促使炎癥及腫瘤的發(fā)展，加重CAG［25］。IL-1β 是一種促炎性細胞因子，炎性信號激活炎癥小體來刺激IL-1β 的分泌，IL-1β 的過量分泌會引起炎癥反應，出現(xiàn)炎性損傷［26］；同時IL-1β 還是一種胃酸分泌抑制劑，持續(xù)的低酸環(huán)境會促進萎縮的發(fā)展，提高胃癌的發(fā)生風險［27］。綜上所述，這些關(guān)鍵靶點基因都在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，是失笑散治療PD和CAG患者的核心靶點。

KEGG 分析表明，失笑散治療PD及CAG 主要表現(xiàn)在癌癥信號通路、AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路等。IL-17 信號通路是一種經(jīng)典炎癥信號通路，此通路上的IL-17 與特異性受體IL17RA、IL17RC結(jié)合，通過胞內(nèi)信號傳導分子ACT1和TRAF6 來激活NF-κB，開啟下游炎癥反應［28-29］。TNF 信號通路與炎癥反應密切相關(guān)，其與腫瘤壞死因子受體1 （TNFR1） 結(jié)合后被激活，激活的TNF 信號通路可促進促炎因子、趨化因子和TNF-α 等基因的表達［30］。TNF可激活胃黏膜中分布的各種炎性細胞，刺激炎性細胞來釋放炎性因子，進而加重胃黏膜的炎癥程度，引起腺體壞死，使固有腺體減少和萎縮［31］。失笑散可能通過作用于以上炎癥相關(guān)通路來抑制炎癥因子的釋放，從而達到治療PD 和CAG 的效果。

分子對接結(jié)果預測到藥物活性成分β-谷甾醇與TNF、TP53、VEGFA、IL-1β 結(jié)合良好，槲皮素與TNF、異鼠李素與TNF 結(jié)合良好，表明失笑散可能通過以上相關(guān)活性成分和核心靶點發(fā)揮治療PD 的效果，為進一步開展動物實驗驗證打下基礎(chǔ)。

本研究后續(xù)開展了PD大鼠體內(nèi)的實驗，對失笑散治療PD 的鎮(zhèn)痛、抗炎機制進行藥效學方面的驗證，結(jié)果表明其可顯著降低子宮指數(shù)、扭體次數(shù)，升高子宮收縮抑制率；對血清中TNF-α、IL-6 及IL-1的表達出現(xiàn)明顯抑制作用；對VEGFA、PTGS2 的表達水平也有顯著抑制作用。此實驗證實了失笑散可能通過抑制炎癥因子的釋放，通過抗炎鎮(zhèn)痛來治療PD。

綜上所述，失笑散可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分與TNF、IL-6、TP53、VEGFA、IL-1β等主要靶點蛋白結(jié)合，抑制IL-17、TNF等炎癥信號通路治療PD及CAG，失笑散的用藥劑量以5 g/kg、10 g/kg為佳。