基于Box-Behnken響應面設計法結合熵權法優化秋水仙堿醇傳遞體的制備工藝*

柯寄明，江素萍，劉艷，嚴佳智，黃山，汪杰，彭燦，2，3，4，張繼穩，5

(1.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230012；2.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，合肥 230012；3.中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 230012；4.安徽省中醫藥研究院，中藥資源保護與開發研究所，合肥 230012；5.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203)

秋水仙堿(colchicine，COL)是一種生物堿，多年來一直用于治療急性痛風[1]。但其首關代謝廣泛、治療指數較低[1-2]和口服生物利用度較差(25%～50%)[3]。此外，口服秋水仙堿會出現輕度至重度的胃腸道副作用，包括腹部絞痛和疼痛、惡心、嘔吐和腹瀉[4]。即使是在治療劑量下，80%患者通常會發生這些副作用[5]。因此，經皮給藥可能為秋水仙堿的給藥方式提供一條新的途徑，以解決口服秋水仙堿的劑量依賴性副作用和生物利用度差的問題。醇傳遞體(transethosomes，TEs)在經皮給藥方面具備醇質體和傳遞體兩種載體的優點[6]，能夠包載親水性或者疏水性的藥物，許多研究已經證明TEs能夠增強具有不同理化性質的藥物的透皮給藥效果[7-10]。TEs在醇質體的基礎上加入表面活性劑，可以增加磷脂分子間的距離，干擾磷脂酞基鏈的順序，從而增加醇傳遞體的流動性[11-12]；TEs在傳遞體的基礎上加入乙醇，高濃度乙醇具有促滲作用[13]，乙醇也作為表面負電荷的供體，可以避免脂質囊泡的聚集，使整個體系更加穩定[14]。

Box-Behnken設計(BBD)是一種流行的配方和工藝優化工具，它利用實驗空間邊緣和中心中點的處理組合。與中心組合設計(CCD)，D-最優設計和3水平因子設計相比，BBD可以用更少的時間和更少的實驗次數來優化處方，并且更具成本效益。此外，BBD沒有軸向點，能夠確保所有設計點都落在安全操作區域內[15-16]。熵權法(entropy weight method，EWM)則是對實驗數據進行整理、計算和分析，從而得到各項實驗指標的權重系數[17]。兩者配合能夠降低人為主觀因素產生的實驗結果偏差，從而使結果更加合理客觀。

當采用BBD考察多個指標的時候，通常對單獨指標逐個進行分析，或者人為主觀地給不同的指標賦權，避免不了主觀因素的介入。因此為優化COL-TEs的處方，采用BBD和EWM進行統計學優化，旨在篩選出COL-TEs的最優處方，為同類型制劑的處方篩選提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(THERMO V3000型，賽默飛世爾科技公司)；高速離心機 (BT-25S型，常州市萬豐儀器制造有限公司)；十萬分之一電子分析天平[AB135-S型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (DF-101S型，鞏義市予華儀器制造有限責任公司)；激光粒徑儀(3000HS型，英國Malvern公司)；透射電鏡(JEM-2100型，日本EILL公司)；超聲細胞破碎儀(SFX型，美國艾默生公司)。

1.2藥品與試劑 秋水仙堿 (COL，西安山川生物技術有限公司，批號：101176-201001，含量：98%)；大豆卵磷脂 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：K1915226，含量>98%)；脫氧膽酸鈉 (上海麥克林生化科技股份有限公司，批號：C11584234，含量：98%)；乙醇 (色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；甲醇 (色譜純，Fisher公司)；超純水。

2 方法與結果

2.1秋水仙堿含量測定

2.1.1色譜條件 Unitaryl C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(60：40) ；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL[18]。

2.1.2標準曲線的繪制 精密稱取COL對照品5 mg，置于10 mL量瓶內，用甲醇配制COL對照品儲備液(500 μg·mL-1)。依次加入甲醇稀釋到濃度為1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.0，200.0，500.0 μg·mL-1的一系列COL對照品溶液。以濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，線性方程為Y=0.601 6X-0.115 9(R2=0.999 7)。該結果表明在1～500 μg·mL-1濃度范圍內峰面積和濃度呈良好的線性關系。日內精密度RSD為0.29%，日間精密度RSD為0.08%，平均回收率為(98.87±0.11)%，符合含量測定要求。

2.2COL-TEs的制備 精密稱取適量大豆卵磷脂，脫氧膽酸鈉于4 mL乙醇中，混合置于錐形瓶當中，加熱溶解。將10 mg的COL加入到水6 mL中形成水相，用注射器將含有COL的水相緩慢注入到錐形瓶中，保持50 ℃恒溫，1300 r·min-1攪拌30 min，探頭超聲(超聲5 s，停5 s，振幅25%，5 min)，過篩孔內徑0.22 μm濾膜即得。

2.3包封率測定

2.3.1方法回收率 精密制備低、中、高濃度(0.1，0.5，1.0 mg·mL-1)的COL溶液，分別取適量于超濾管中離心(4000 r·min-1，30 min)，收集續濾液，將超濾前后藥物溶液進樣分析，計算游離藥物回收率。COL的回收率>95%，符合要求，見表1。

表1 COL的回收實驗結果

2.3.2加樣回收率 精密取COL適量加至空白醇傳遞體中，使COL的濃度分別為0.1，0.5，1.0 mg·mL-1，分別取適量于超濾管中離心(4000 r·min-1，30 min)，收集續濾液，將超濾前后藥物溶液進樣分析，計算回收率。COL的加樣回收率>95%，符合醇傳遞體包封率測定方法的要求，見表2。

表2 加空白醇傳遞體后COL的回收率

2.3.3包封率測定方法 精密量取COL-TEs適量置于超濾離心管中，離心(4000 r·min-1，30 min)后取外管液體用甲醇定容至10 mL，按“2.1.1”項色譜條件測定秋水仙堿含量記為W1。取同體積COL-TEs甲醇定容至10 mL，超聲破乳，按“2.1.1”項色譜條件測定秋水仙堿含量記為W2。計算包封率，包封率(%)=(W2-W1)/W2×100。

2.4粒徑、PDI和Zeta電位測定 移取適量COL-TEs到樣品池中，利用激光粒徑儀對其進行粒徑、分散系數(PDI)和Zeta電位的檢測。

2.5工藝優化

2.5.1因素水平表的確定 根據預實驗結果，確定溫度為50 ℃，轉速為1300 r·min-1，攪拌時間為30 min。選擇對實驗影響較大的因素進行BBD優化。以卵磷脂用量(A)、脫氧膽酸鈉用量(B)、乙醇體積(C)為考察因素，以粒徑、PDI、Zeta電位和包封率為指標，采用BBD對COL-TEs處方進行優化，因素水平見表3。

表3 因素和水平設計

2.5.2信息熵法對數據的分析 信息論里，度量不確定性用熵表示。為了消除人為因素的影響，在確定評價指標權重時采用了客觀熵權法。運用熵權法，將每個評價指標視為一個隨機變量，計算該指標的熵權系數，其取值變異程度越大，越無序，信息量提供的就越多，該指標就越重要；反之亦然。因此，熵權法是更為客觀的一種賦權法[19-20]。用熵權法分配權重的計算步驟如下。

①指標歸一化處理：設m個評價指標n個評價對象的原始數據矩陣為X=(aij)mn，對其歸一化后得到X'=(xij)mn，對正向指標而言，用以下公式進行歸一化。

X'ij=(aij-minj{aij{)/maxj{aij}-minj {aij})，X'ij表示第 i 次實驗時第j個評價指標的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

②將原始數據陣(aij)mn轉換為概率矩陣(Pij)mn；在信息熵公式中 Pi 為某個信息的概率，滿足0≤Pi≤1，因此必須先對矩陣(aij)mn做歸一化處理，經處理后的矩陣可視為評價指標的概率矩陣。其中Pij表示第j次實驗在第i個評價指標下的概率。

③計算指標的熵值，確定第i個評價指標的信息熵(Hi)。

④計算指標的熵權系數(Wj)。

經過計算，得到各指標熵值和權重系數，見表4。

表4 各指標熵值及權重系數

2.5.3實驗安排 根據因素水平表，選擇優化方法，根據實驗隨機安排進行優化實驗。運用Design-Expert軟件對數據進行二次多元回歸擬合分析，得到卵磷脂用量(A)、脫氧膽酸鈉用量(B)、乙醇體積(C)與綜合評分(Y)之間的模型方程。對綜合評分值模型進行方差分析。

BBD的方案及綜合評分的結果見表5。利用軟件對表5中數據進行二次多元回歸擬合分析，得到A、B、C與Y之間的二次多元回歸模型方程：Y=0.041 610 6+0.010 574 1A+0.007 182 37B+0.010 803 1C-0.003 834 08AB+0.012 226 4AC+0.006 103 34A2+0.003 906 19B2+0.026 567 9C2，以綜合評分值模型進行方差分析，方程決定系數，R2=0.780 1。

表5 BBD-響應面實驗的設計與結果

方差分析結果見表6。模型的P<0.05，可信度高，失擬項不顯著，說明該模型擬合度較好且差異有統計學意義，可以對不同條件下的目標指標進行預測，因此該模型可用于處方的篩選與預測。

表6 方差分析結果

2.5.4效應面優化 根據擬合的模型，采用Design-Expert軟件生成綜合評分值隨因素變化的三維曲面圖和等高線圖。等高線圖和三維圖能夠預測和檢驗各因素與綜合評分之間的關系。由圖1可知，AB、AC的等高線呈橢圓形，說明卵磷脂和脫氧膽酸鈉、卵磷脂和乙醇兩者之間的交互作用明顯，說明AB、AC的交互作用對綜合評分影響較大。

圖1 不同因素對綜合評分值影響的等高線圖與響應面圖

2.5.5COL-TEs最優處方的驗證 結合二次回歸方程，求解得到最佳處方為卵磷脂500 mg，脫氧膽酸鈉50 mg，乙醇4 mL(綜合評分預測值0.115)。在該工藝下平行實驗3次，測定指標包封率、電位、PDI和粒徑，見圖2和圖3。實測包封率分別是60.99%，60.6%，59.12%；粒徑分別是151，112.8，116.7 nm；Zeta電位分別是-14.5，-16，-16.9 mV；PDI分別是0.205，0.211，0.262。對應的綜合評分分別是0.106 2，0.108 8和0.107 4，與預測值的RSD為3.39%，證明該工藝穩定可靠。

圖2 COL-TEs的粒徑分布圖

圖3 COL-TEs的Zeta電位圖

2.5.6COL-TEs形態考察 吸取適量最優處方樣品滴于銅網上，10 min后用濾紙沿邊緣吸干，然后用2%磷鎢酸進行染色，放置6 min，待其風干后，用透射電鏡觀察最優處方下COL-TEs的形態，見圖4，可以看出，最優處方下的COL-TEs呈類球形，且互相沒有粘附，分布均勻，大小均一，說明制得的最優處方分散性良好。

圖4 COL-TEs的透射電鏡圖

3 討論

秋水仙堿既可以溶于水也可以溶于乙醇，所以測定包封率的時候用超濾離心管進行測定，避免分離方法對測定結果的影響[21]。由于秋水仙堿的溶解性，導致其在脂質載體中的包封率不高[22]，所以本研究除了將COL-TEs的一些基礎的表征(粒徑、電位和PDI)作為考察指標，同時也將包封率作為研究指標。當同時選取多個指標的時候，需要單獨對每個指標進行分析，無法避免人為主觀因素的介入[23]。有研究用主觀賦權的方法將2個指標分配權重，得到一個綜合評分，從而進行處方的篩選[24]。但當考察因素超過2個時，這樣的賦權方式不客觀。本文為了避免人為因素的影響，利用客觀熵權法獲得評價指標的權重。該法可以根據每個指標的熵權系數的取值變異程度來判斷指標的重要程度。經過其處理，包封率的權重最大，電位次之，粒徑和PDI相差不大，說明實驗得出包封率的結果變異程度高，是4個指標中最重要的指標，粒徑和PDI隨考察因素的改變而變化不大，所以分配的權重不高。利用個人經驗賦權常常會使實驗結果出現偏差，運用熵權法計算各指標的權重，結果更合理可靠。根據擬合方程優選工藝條件，由此制備的COL-TEs測量值與預測值偏差較小，相關性好，BBD結合熵權法為篩選出最優的處方提供了可靠的數據。優化后所制得的COL-TEs大小均一，分布均勻，電位穩定，包封率優于主動載藥的秋水仙堿脂質體[25]和醇質體[26]，滿足用于透皮給藥TEs的要求。目前，國內使用Box-Behnken響應面設計法結合熵權法多用于中藥提取工藝[27]和提取物干燥工藝優化[28-29]。基于此，BBD結合熵權法可以為同類型的制劑處方篩選提供參考依據，適合需要考察多個指標的制備工藝的選擇。