電感耦合等離子體質譜法測定甲硝唑原料藥(供注射用)中10種元素雜質含量

吳奔紅，樊華軍，汪秋蘭，武玉婧，施春陽

[1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，武漢 430030；2.英格爾檢測技術服務(上海)有限公司，上海 200000；3.甘肅省白銀市藥品檢驗檢測中心，白銀 730900]

甲硝唑為硝基咪唑類藥物，對革蘭陰性厭氧菌和革蘭陽性菌均具有較好的抗菌活性，對原蟲感染也具有較好的療效，臨床應用非常廣泛，是世界衛生組織(WHO) 基本藥物[1-2]。目前國內已上市的甲硝唑制劑有片劑、膠囊劑、注射劑、栓劑和凝膠劑[3]。

2020年5月國家藥品監督管理局發布《關于開展化學藥品注射劑仿制藥質量與療效一致性評價工作的公告》，要求對注射劑仿制藥開展一致性評價，藥品審評中心也發布配套指導原則[4-6]，從多方面對注射劑仿制藥一致性評價提出技術要求，明確要求根據國際人用藥物注冊技術協調會議(ICH) Q3D元素雜質指導原則的規定，對注射劑原料藥的元素雜質進行評估和控制。ICH Q3D元素雜質指導原則將元素雜質分為三類，注射途徑給藥要求對第1類(砷、鎘、汞、鉛)，第2(A)類(鈷、鎳、釩)和第3類中的鋰、銅、銻10種元素進行風險控制[7]。華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部長期從事甲硝唑原料和制劑研究[8-11]，先后幫助企業獲得甲硝唑原料藥批準文號和歐盟CEP證書，通過甲硝唑片一致性評價，目前正在開展甲硝唑注射液一致性評價工作。筆者在本文參照USP<233>元素雜質檢查法和《中華人民共和國藥典》(2020年版)0412電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass spectrometry ，ICP-MS)法指導原則，建立ICP-MS法測定甲硝唑原料藥(供注射用)中10種元素，并進行了方法學驗證，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 NexION 1000型電感耦合等離子體質譜儀(PE公司)；WX-8000型微波消解儀(上海屹堯儀器科技發展有限公司)；BSA224S型電子分析天平(德國Sartorius公司，感量：0.1 mg)；UPT-II-5T型超純水儀(Ulupure公司)。

1.2試藥 標準溶液：鉛(Pb)(批號：B1906159)、鎘(Cd)(批號：B1912124)、鈷(Co)(批號：B1902041)購于北京壇墨質檢科技有限公司；汞(Hg)(批號：20A038-7)、釩(V)(批號：20A020-3)、砷(As)(批號：207003-4)、鎳(Ni)(批號：208002-8)、金(Au)(批號：19C003-1)購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鋰(Li)(批號：1094768-26)、銻(Sb)(批號：1129139-14)購于上海安譜實驗科技股份有限公司；銅(Cu)(批號：R2-CU693029)購于Inorganic Ventures公司。內標：銦(117In)(批號：B1912042)購于北京壇墨質檢科技有限公司；鍺(74Ge)(批號：19B028)、鈧(45Sc)(批號：2027033)購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。各元素濃度均為1000 μg·mL-1。硝酸(上海凌峰化學試劑有限公司，優級純)。自制純化水。甲硝唑原料藥(供注射用)批號為0181812001，0181912313，0181912314，由湖北省宏源藥業科技股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1元素雜質限度的確定 參照ICH Q3D元素雜質指導原則，確定Pb、As、Cd、Hg、V、Ni、Co、Li、Cu、Sb 10種元素的注射每日允許暴露量(PDE)，每日藥物攝取量不超10 g的藥品，限度值(μg·g-1)=PDE(μg·d-1)/藥物日用量(g·d-1)，見表1。

表1 元素雜質允許濃度值

2.2ICP-MS儀器條件 射頻功率1 600 W，霧化器流速1.00 L·min-1，碰撞氣流速4.60 mL·min-1(Pb和Hg為5.50 mL·min-1)，蠕動泵轉速為35 r·min-1，測量模式為碰撞池模式KED(Kinetic Energy Discrimination)。

2.3溶液制備

2.3.1標準品儲備溶液制備 精密量取Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb標準溶液適量，分別用4%硝酸溶液定量稀釋制成標準儲備溶液，濃度依次為125.00，50.00，75.00，125.00，250.00，500.00，375.00，6.25×103，7.50×103，2.25×103ng·mL-1。

2.3.2內標溶液 分別精密量取74Ge、115In、45Sc標準溶液 0.2 mL，置1 L量瓶中，用4%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得混合內標溶液。

2.3.3供試品溶液和空白溶液 取本品0.25 g，精密稱定，置微波消解罐中，加硝酸5 mL，100 ℃條件下預消解2 h，置微波消解儀中按120 ℃3 min，150 ℃3 min，180 ℃3 min，200 ℃30 min，依次進行消解，冷卻至室溫，120 ℃趕酸1 h，放冷。將消解罐內溶液轉移至50 mL量瓶中，用水洗滌3次，合并洗液于量瓶中(含2.00 ng·mL-1Au)，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

2.3.4標準曲線溶液 分別精密量取“2.3.1”項下Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb標準品儲備液各0.2，0.5，0.8，1.0，2.0 mL，分別置50 mL量瓶中(編號S1～S5)，用4%硝酸溶液(含2.00 ng·mL-1Au)稀釋至刻度，搖勻，以4%硝酸溶液(含2.00 ng·mL-1Au)為空白溶劑(編號為S0)，見表2。

表2 10種成分標準曲線溶液濃度

2.4測定法 內標溶液采用在線內標加入法，樣品管中依次引入標準曲線溶液、空白溶液、供試品溶液，制作標準曲線，根據標準曲線方程得到各元素雜質濃度，根據公式1計算元素雜質含量。測定Co、V、Ni、As、Cu時，以74Ge為內標元素，測定Pb、Cd、Hg、Sb時，以115In為內標元素，測定Li時，以45Sc為內標元素。含量(μg·g-1)=元素濃度(ng·mL-1)×溶液體積(mL)×10-3/稱樣量(g)。

2.5方法學驗證

2.5.1系統適用性實驗 按照“2.3.3”項下制備供試品溶液，加入各元素標準品儲備溶液適量，使待測元素濃度為限度濃度，即得加標供試品溶液。在供試品溶液測定前后，分別測定加標供試品溶液 3次。結果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素的信號漂移值分別為1.31%，1.70%，6.45%，2.16%，0.70%，1.00%，2.76%，3.15%，3.19%，均<20%，表明此方法系統適用性良好。

2.5.2線性關系考察 取標準曲線溶液進樣分析，以待測元素與所用內標元素響應值的比值(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果表明10種元素在0～200%限度范圍內，線性關系良好，相關系數r均≥0.999 8。結果見表3。

2.5.3檢測限與定量限 取“2.3.3”項下空白溶液進ICP-MS分析，重復測定21次，記錄空白響應值(cps)，計算標準偏差(δ)。根據公式(LOD=3δ/S)計算檢測限(LOD)，公式(LOQ=10δ/S)計算定量限(LOQ)，S為各元素標準曲線斜率。結果見表3。

表3 10種成分回歸方程、線性范圍、相關系數、檢測限及定量限

2.5.4重復性實驗 按照“2.5.1”項下方法制備6份加標供試品溶液，進ICP-MS分析，計算各元素含量RSD(n=6)。根據USP<233>重復性要求，RSD應≤20%。結果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素的RSD分別為2.04%，5.32%，5.68%，3.39%，4.84%，2.41%，3.92%，4.25%，1.87%，4.03%，表明該方法重復性良好。

2.5.5中間精密度實驗 由另一名分析人員按照“2.5.1”項下方法制備6份加標供試品溶液，進ICP-MS分析，結合重復性實驗結果，計算各元素含量RSD(n=12)。根據USP<233>中間精密度要求，RSD應≤25%。結果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素的RSD分別為9.41%，5.77%，8.76%，3.59%，4.83%，3.71%，3.78%，4.99%，3.45%，9.19%，表明該方法中間精密度良好。

2.5.6準確度實驗 取甲硝唑原料藥(供注射用)樣品(批號：0181812001)0.25 g 9份，精密稱定，分別按限度濃度80%，100%，120%加入標準品儲備溶液，作為低、中、高3個濃度的加標供試品溶液，每個濃度制備3個平行樣品，進行加樣回收實驗。10種元素的回收率在76.58%～116.48%范圍內，符合USP<233>中回收率在70%～150%范圍內的要求。結果見表4。

表4 10種成分回收實驗結果

2.5.7耐用性實驗 參照 “2.3.3”供試品溶液制備方法，將“2.3.3”項微波消解程序第4步的200 ℃下調至195 ℃，或上調至205 ℃，制備供試品溶液，再按照“2.5.1”項下制備加標供試品溶液，進行ICP-MS分析，測定各元素含量。取“2.5.1”項下加標供試品溶液，將儀器泵速由35 r·min-1下調至33 r·min-1，或上調至37 r·min-1，測定各元素含量。每個條件下測定3次，計算各元素含量RSD(n=6)。改變消解溫度組中，結果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素RSD分別為1.46%，2.14%，2.55%，4.12%，5.03%，4.29%，5.27%，2.93%，1.63%，7.99%。改變泵速組中10種元素RSD分別為5.10%，5.69%，6.37%，2.87%，2.76%，2.35%，2.99%，3.63%，4.13%，5.06%，說明該方法耐用性良好。

2.5.8樣品測定 取3批甲硝唑原料藥(供注射用)樣品，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進行ICP-MS分析，儀器自動測試3次，取3次測量平均值，以標準曲線計算各元素含量。結果批號0181812001，0181912313，0181912314樣品中Hg含量分別為0.018，0.009，0.008 μg·g-1；V含量分別為0.006，0.007，0.006 μg·g-1；Ni含量分別為0.037，0.021，0.020 μg·g-1。Pb、Cd、Co、As、Li、Cu和Sb均未檢出。3批樣品中各元素雜質含量遠低于限度值，說明3批甲硝唑原料藥(供注射用)無元素雜質風險。

3 討論

雜質控制和分析是藥品研發的重點和難點。元素雜質又稱重金屬，原義指比重大于5的金屬，元素雜質包括可能存在于原輔料或制劑中的催化劑和環境污染物，主要在藥品生產或貯藏過程中生成、加入或無意引入的物質[7]。在早期的各國藥典中，對元素雜質的控制主要是針對重金屬和部分無機雜質，檢測方法主要包括重金屬實驗、熾灼殘渣、硫化物和砷鹽檢查以及其他的化學檢查法。

隨著藥品生產過程中催化劑和試劑應用的日益廣泛，近年來元素污染的風險越來越大，研究發現某些元素雜質具有毒性，還可能對藥品的穩定性、保質期帶來不利影響。因此世界各國藥品監管機構對藥品元素雜質的控制越來越嚴格，各國藥典經過多次更新，目前對元素雜質要求基本上和ICH Q3D保持一致。隨著我國2017年加入ICH，《中華人民共和國藥典》 (2020年版) 四部通則收錄的9102藥品雜質分析指導原則也加入元素雜質的控制要求，其規定與ICH幾乎一致，提高我國藥品中元素雜質控制水平和保障患者用藥安全勢在必行。

ICH Q3D推薦ICP-MS法和ICP-OES法為元素雜質的檢測方法。ICP-OES比較，ICP-MS檢測限更低，更適用于痕量和超痕量分析，譜線簡單，可避免光譜干擾對測定結果的影響[12]，因此本實驗選擇ICP-MS法。該法采用內標法校正基體效應，選擇質量數和電離能與待測元素相近的元素作為內標[13]，以提高分析方法的精密度。在本研究中，測定59Co、51V、60Ni、75As、63Cu時，以74Ge為內標元素，測定208Pb、111Cd、202Hg、121Sb時以115In為內標元素，測定7Li時，以45Sc為內標元素。

該法采用碰撞-反應池模式(KED)校正質譜干擾，以氦氣為碰撞氣體，利用干擾離子的碰撞截面比待測目標離子大，碰撞幾率增加，損失更多的動能，干擾離子無法進入四級桿而達到消除干擾的目的[14]。KED消除干擾的能力受碰撞氣流速的影響，不同元素需設置合適的碰撞氣流速，背景等效濃度(BEC)值越低，靈敏度就越高。本研究中優化碰撞氣流速時發現，當流速為4.6 mL·min-1時，Pb、Hg的BEC值較高，其他元素BEC值較低；當流速為5.5 mL·min-1時，可降低Pb、Hg的BEC值。