賽樂西帕中甲磺酸酯雜質的來源分析與檢測

＊馬天華 賴廣健 華瑩 黃雅婷 劉恩萍 王云中

（普濟生物科技（臺州）有限公司 浙江 318000）

前言

磺酸酯類雜質作為遺傳毒性雜質之一，格外受到關注。2000年歐洲藥典指出原料藥和磺酸在醇溶液中成鹽可能產生磺酸酯類雜質，其形成機制于2006年由Snodin[1]首次預測，后來由Teasdale等通過實驗證實。2007年7月6日歐洲藥監局宣布抗艾滋病藥物奈非那韋甲磺酸鹽停止使用，原因是奈非那韋甲磺酸鹽中EMS在藥物劑量2.5g/d下攝入量高達2.5mg/d，遠高于毒理學關注閾值，甲磺酸等磺酸類物質與微量的低級醇會反應生成烷基磺酸如甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）和甲磺酸異丙酯（IMS），它們易與DNA發生烷基化反應，從而可能成為引發癌癥的誘因。因此，評估藥物中磺酸酯潛在來源，對它們進行分析檢測，制定合理的控制策略是非常重要和有意義的。

1.甲磺酸酯來源分析

根據文獻[2-4]報道，賽樂西帕常見合成策略如圖1所示。

圖1 賽樂西帕常見合成策略

合成策略1中使用到甲磺酰氯，采用本策略合成賽樂西帕極有可能有甲磺酸或者甲磺酰氯殘留；合成策略2中使用到的甲磺酰胺，由甲磺酰氯和氨反應產生；合成策略3中的中間體4，主要由鹵代乙酰鹵和甲磺酰胺反應來制備，因此采用策略2和3合成賽樂西帕也有甲磺酸或者甲磺酰氯存在可能。另一方面，甲醇、乙醇、異丙醇等低級醇在原料藥合成過程中使用極其普遍，而且其潛在來源如酯類溶劑的水解、醚的水解等也很常見。當甲磺酸或者甲磺酰氯在有甲醇、乙醇、異丙醇等低級醇存在時都容易發生反應生成具有遺傳毒性雜質MMS、EMS和IMS。而且在這些合成策略中，甲磺酸和甲磺酰氯殘留集中在合成工藝的末端，進一步增加了原料藥中磺酸酯殘留的風險。因此，需要基于賽樂西帕合成工藝中甲醇、乙醇和異丙醇等低級醇的實際使用情況以及工藝中低級醇潛在來源對賽樂西帕合成工藝中產生MMS、EMS和IMS的可能性進行評估。一旦確認存在甲磺酸酯的可能，應基于國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）相關指導原則，結合賽樂西帕產品特性制定合理甲磺酸酯控制策略，并使用經過驗證的分析方法對產品進行檢測，以證明產品中甲磺酸酯含量水平是安全可控的。

2.檢測方法研究進展

甲磺酸酯類雜質檢測方法研究較多，常用的有氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）法等。例如：Taylor 等[5]使用LC-MS法在單離子模式下直接檢測MMS、EMS和IMS。Alzaga等[6]報道衍生化HS-GC-MS法測定原料藥中的9種磺酸酯，該方法衍生物揮發性好，檢測靈敏度高，確定了磺酸酯檢測通過分析物衍生的可行性。Filby等[7]利用氣相色譜-火焰離子化檢測器（GC-FID）對包括MMS等13種有機硫化合物進行檢測。Ramjit等[8]開發了一種GC-MS方法來識別和量化正性肌力藥物DPI 201-106的雙甲磺酸鹽中甲磺酸酯。研究結論表明DPI 201-106的游離堿中不含任何可檢測水平的甲磺酸酯，而雙甲磺酸鹽分別含有0.51×10-6和1.31×10-6的MMS和EMS，這進一步說明甲磺酸的存在易與低級醇生成甲磺酸酯。在常用磺酸酯檢測方法中，直接進樣方式的氣相色譜法易引入非揮發性物質，存在進樣重復性差和準確度不達標；頂空進樣方式的氣相色譜法可以避免藥品基質的干擾，但由于磺酸酯沸點較高，同樣會限制方法的靈敏度；其他檢測方法如LC-MS亦有基質干擾，靈敏度低等缺點。因此，根據原料藥性質和磺酸酯種類不同，針對特定原料藥中的磺酸酯開發檢測方法是必要的。

3.檢測方法開發

鑒于賽樂西帕化學性質，本試驗中采用衍生化HS-GC-MS法對賽樂西帕原料藥中MMS、EMS和IMS進行測定，研究方法具體如下：

(1)色譜條件

表1 色譜條件及質譜參數

(2)溶液配制

稱取碳酸氫鈉5g、30mg無水硫代硫酸鈉和60g碘化鈉至50mL容量瓶中，加水超聲溶解，并稀釋到刻度得到衍生化溶液；精密移取甲磺酸正丁酯10μL，置25mL量瓶中，加甲苯稀釋至刻度，再精密量取20μL，置100mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度得內標溶液；精密移取衍生化溶液0.5mL和內標溶液1.5mL，置20mL頂空瓶中，密封得到空白溶液；精密稱取供試品約25mg，置于20mL頂空瓶中，精密加入衍生化溶液0.5mL和內標溶液1.5mL，密封得到供試品溶液；分別精密稱取MMS、EMS和IMS各約25mg，用DMF溶解并稀釋至5.0mL。精密移取50μL，置25ml容量瓶中，加內標溶液稀釋至刻度，混勻得到對照品儲備液，精密量取對照品貯備液0.5mL，置20mL容量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度得對照品中間儲備液，精密移取0.5mL對照品中間儲備液和衍生化溶液1.5mL，置20mL頂空瓶中，密封得對照品溶液。室溫條件下，對照品溶液4h穩定，其方法對照品限度為5×10-6，質量濃度為0.25μg·mL-1。

4.方法學驗證

(1)專屬性試驗

稱取供試品約25mg，移取衍生試劑與對照品貯備液各1mL置頂空瓶，進樣。

圖2中MMS、EMS和IMS的保留時間分別為2.39min、2.84min和3.06min，各雜質峰間的分離度良好，且空白不干擾測定。

圖2 專屬性溶液色譜圖

(2)檢測限和定量限

取MMS、EMS和IMS溶液貯備液逐級稀釋。信噪比為10時，MMS、EMS和IMS的定量限分為0.0127μg·mL-1、0.0136μg·mL-1和0.0125μg·mL-1；信噪比為3時，MMS、EMS和IMS的定量限分為0.0064μg·mL-1、0.0078μg·mL-1和0.0063μg·mL-1，檢測限（相對供試品濃度12.5mg·mL-1）分別為1×10-6、1×10-6和1×10-6。

(3)線性考察

取MMS、EMS和IMS適量，精密稱定，依次稀釋，制成濃度范圍在0.013～0.32μg·mL-1的系列標準溶液。采用頂空氣相色譜質譜法進行檢測分析，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，并及時回歸方程和相關系數，結果見表2～表4。

表2 甲磺酸甲酯的衍生化產物碘甲烷的線性與范圍實驗結果

表3 甲磺酸乙酯的衍生化產物碘乙烷的線性與范圍實驗結果

表4 甲磺酸異丙酯的衍生化產物碘異丙烷的線性與范圍實驗結果

(4)重復性試驗

取供試品25mg，加入MMS、EMS和IMS適量，使供試品溶液中含有約0.0625μg·mL-1的MMS、EMS和IMS，即重復性溶液（n=6）。結果MMS、EMS和IMS的平均回收率分別為103.5923%、102.6765%和104.2078%，且RSD分別為1.05%、0.51%和0.38%，重復性良好。

(5)回收率試驗

取供試品25mg，分別加入MMS、EMS和IMS適量，使供試品溶液中含有約0.0125μg·mL-1、0.0625 μg·mL-1和0.125μg·mL-1的MMS、EMS和IMS，即加樣回收溶液（n=3）。結果MMS、EMS和IMS的平均回收率分別為105.4283%、103.0952%和103.7930%，其RSD（n=9）分別為2.85%、1.20%和0.73%，回收率良好。

(6)穩定性

取賽樂西帕供試品，加入對照溶液，即得0.0625 μg·mL-1的加標供試品溶液。分別于0h、4h、12h注入色譜儀，MMS、EMS和IMS 12h的峰面積相對于0h的峰面積未有超過5%以上的變化，考察結果表明：樣品溶液穩定性良好。

(7)樣品中甲磺酸酯測定

取賽樂西帕原料藥各適量，按上述驗證后的分析方法檢測，結果顯示一批有EMS檢出，含量小于5×10-6，未檢出MMS和IMS，另一批均未檢出MMS、EMS和IMS。

5.結論

本文從不同賽樂西帕合成策略上分析賽樂西帕合成過程中產生MMS、EMS和IMS的潛在可能，開發了衍生化HS-GC-MS方法測定賽樂西帕原料藥中MMS、EMS和IMS含量，并完成方法驗證。該方法靈敏度高、重復性好，滿足檢測要求。通過對賽樂西帕樣品檢測，證實賽樂西帕合成過程中確實存在產生MMS、EMS和IMS并最終在API中殘留的可能性。