二代測序技術在顱內感染中的應用

吳佳諾 蘇高健 鄧宇航 李欣夢 劉紫薇 黃賢鍵

深圳大學第一附屬醫院深圳市第二人民醫院，廣東 深圳 518000

顱內感染是神經外科常見疾病之一，也是神經外科術后嚴重并發癥之一，且顱內感染不同于其他部位的感染，不僅病情進展迅速而且由于血腦屏障的存在，很多藥物難以在顱內達到血藥濃度［1］。現階段院內顱內感染往往以耐藥菌為主，因此確定病原菌種類尤其重要［2-3］。二代測序技術（next generation sequencing technology，NGS）作為一種基于PCR 和基因芯片發展而來的DNA 測序技術，不同于經典的細菌或真菌培養、涂片等方法，該技術憑借高通量、快速高效、高精度描述病原體的轉錄組和基因組，可以精準地分析病原體類型［4］；有利于深化人們對于神經系統感染性疾病的認識，尤其是對于一些罕見的病原體感染的認識，從而可以更好地指導臨床診斷與治療。

1 神經系統感染性疾病診斷現狀

神經系統感染性疾病是由病原體入侵中樞神經系統或外周神經系統導致人體出現相應臨床癥狀的一組疾病，具體可表現為腦或脊髓炎，腦膜或脊膜炎，腦膿腫等，可由細菌、病毒、真菌、立克次體、寄生蟲等多種病原體引起［3-5］。在NGS 推廣應用于臨床之前，神經系統感染性疾病的診斷主要依靠檢測腦脊液白細胞、化合物、病原體培養甚至腦組織活檢，但受限于顱內感染病原體培養時間長且容易受到污染菌干擾、組織取材困難等因素［6］。NGS技術可以高通量、高效率的檢出病原體［7］，不依賴經典的病原體培養，不需要使用特定的引物，只需一次運行即可測得所感染病原體類型及菌落特點，并可提供耐藥性預測等信息從而為臨床診治提供幫助［8］。NGS 自第1例檢驗并診斷顱內感染病例至今，其已推廣應用于臨床很長時間。現有臨床研究表明NGS很可能成為神經系統感染性疾病的重要診斷工具，尤其是對于罕見病原體診斷其已具有無法替代的作用，另外NGS也可以檢出一些目前未知的會引發神經系統感染病原體［9］。2012年北京協和醫院運用高通量檢測技術，從一名疑似為病毒性腦炎患兒腦脊液中檢出Parechovirus病毒（副腸孤病毒）［10］。2015年Sakiyama等［11］報道4例表現為腦脊髓膜炎的漁民，他們在常規檢查包括活檢都未能明確致病病原體，但通過NGS檢測明確其感染既往未報道過的屬于古細菌域的嗜鹽菌（Halobacterium），診斷明確后給予復方磺胺甲惡唑治療后患者完全好轉。由此可見，NGS 在罕見及未知病原體檢測方面有極大的潛力［5-6］。

2 NGS技術原理簡介

自1975 年Sanger 和Coulson 開創鏈終止法測序技術（Sanger 測序技術/一代測序技術）［12］，并由Sanger 于1977 年測定了第一個基因序列，人們從此步入了基因組學時代［13］。一代測序技術雖可以測長達1 000 bp 序列［14-15］，且準確率高達99.999%，但由于其測序成本高、通量低，NGS 技術應運而生。NGS技術主要步驟如下［16-18］：首先，利用超聲波將待測DNA 樣本打斷成200～500 bp 的片段，并在這些片段兩端添加不同接頭，從而構建出DNA 文庫；其次，使DNA 片段通過Flow cell（用于吸附DNA 片段的槽道），DNA 片段會隨機吸附于Flow cell 的通道上，通道上的接頭可與DNA 片段上的接頭連接從而支持DNA片段在其表面上橋式PCR擴增，待形成1 000個拷貝后就形成了簇。向反應體系中同時加入DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4 種dNTP，接著加入激發熒光所需的緩沖液并用激光激發熒光信號；最后，運用計算機將熒光信號轉化為測序堿基，并提供生物體全面功能圖，通過生物信息軟件進行分析，在基因組流行病學中心網站上分析NGS 數據，與已知參考基因作比對、定位以及整合分析。

3 NGS技術在神經系統感染性疾病中的應用

3.1 NGS 在細菌方面的應用細菌性顱內感染是神經外科術后常見并發癥之一［19］，據統計全球每年因化膿性細菌所引起的化膿性腦膜炎（purulent meningitis，PM）病例數高達120 萬之多，在歐美等發達國家中成年人發病率為0.4‰～0.6‰［20］，目前國內尚缺乏此類流行病學數據。由于廣譜抗生素濫用、病原學診斷不明等因素，化膿性腦膜炎病死率高達30%～50%，且約50%存活者會出現神經后遺癥［15］。早期精準診斷及早期正確使用抗生素可提高患者存活率及減少后遺癥，研究顯示傳統分離培養檢測特異度高達97%，但敏感度不穩定，波動于25%～90%［21］。NGS 作為一種新興的檢驗技術可以顯著提高PM 診斷準確率及診斷效率，運用傳統腦脊液涂片或培養聯合NGS可將敏感性提升至68.7%［15，22］。由此可見，NGS與傳統涂片或培養互補，可明顯提高PM病原菌的確診率，從而降低PM致死率及致殘率。

3.2 NGS 在真菌方面的應用真菌性腦膜炎是由真菌（包括霉菌、酵母菌及二項性真菌）所引起的中樞神經系統感染性疾病，其起病隱匿，多表現為亞急性或慢性，目前臨床上診斷的“金標準”為病理學檢查［23］。但病理學檢查是有創檢測且存在取材相對困難的劣勢，而腦脊液NGS取材相對容易，靈敏度較高且特異性較強。文獻報道全球每年新發約22萬例隱球菌性腦膜炎病例，致死率高達80%［24］。隱球菌性腦膜炎發病隱匿且影像學表現不明顯，目前診斷主要依靠腦脊液墨汁染色、真菌培養以及莢膜抗原檢測。運用NGS 診斷隱球菌性腦膜炎，其敏感度為75%，特異度為99.47%，陽性率為90%，陰性率為98.43%［15］。傳統檢測方法中僅有莢膜抗原染色敏感度高于NGS，其特異性略低于NGS，但由于莢膜抗原染色依賴莢膜結構，而缺乏莢膜結構的隱球菌所致隱球菌性腦膜炎則無法檢測。由此可見，隱球菌性腦膜炎疑似感染者應盡早采用多種檢測方法聯合檢驗以提高檢出率，從而為治療方案提供依據，NGS有潛力成為針對真菌性中樞性神經系統感染的一線檢測方法。

3.3 NGS 在病毒方面的應用病毒是中樞神經系統感染最常見的感染病原體，其中以病毒性腦炎、腦膜炎為主［25］。已知至少100 種病毒可導致中樞神經系統感染，其中以單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、腺病毒為主。病毒性腦炎診斷的金標準是腦活檢中發現病毒顆粒，但該檢查是一種侵入性檢查，不僅對患者創傷大而且花費高［26］，目前臨床診斷以傳統實驗室檢查及影像學檢查為主，但只有不到50%的患者可發現特異病原體，因此臨床治療往往依靠經驗治療［27］。在一項46份腦脊液樣本的研究中，將NGS與傳統PCR 進行對比，發現46 份CSF 樣本中有6 份PCR 呈陽性，而有14 份NGS 呈陽性，表明NGS 與傳統PCR分析相比，檢測率顯著提高［28］。研究表明，病毒性腦炎早期進行NGS 其陽性率為58.33%，而在后期進行NGS其陽性率下降［15］。雖然NGS對于病毒性腦炎檢出率不高，但早期行NGS 聯合實驗室檢查是有必要的。

3.4 NGS 在寄生蟲方面的應用臨床上顱內寄生蟲確診率低，影響神經系統寄生蟲病的診治。腦寄生蟲病中最常見的為腦囊蟲病，其致病病原體主要為豬帶絳蟲，其臨床表現極為復雜，主要取決于囊尾蚴的寄生部位、種類、數量、大小以及宿主對囊尾蚴的免疫反應等［29］，病程緩慢，最長可至30 a［30］。目前臨床診斷主要依靠影像學及腦脊液常規生化，但往往缺乏特異性，尤其是非腦實質的腦囊蟲病。NGS可檢測標本中全部基因組序列，寄生蟲的DNA 可在驅蟲治療后長時間留存于腦脊液之中。2021年深圳市兒童醫院利用NGS測序確診2例兒童廣州管圓線蟲（angiostrongylus cantonensis，AC）腦膜炎，在予以阿苯達唑治療后，2 例患兒均完全好轉，此2 例患兒在確診寄生蟲感染前按細菌性腦膜炎治療均無好轉，其中1 例患兒反而加重［31］。目前針對寄生蟲的NGS 檢測技術主要集中在基因組測序、基因表達分析、非編碼小分子RNA的鑒定、轉錄因子靶基因的篩選、耐藥基因監測等方面［32］。

4 NGS技術面臨的困境

4.1 標本取材困難自NGS 技術在臨床應用以來，成功檢測顱內病原體的病例時有報道，但NGS 技術也面臨一些困境。由于血腦屏障的存在，腦脊液病原學檢測是診斷顱內感染的金標準［33］。中樞神經系統感染性疾病標本取材復雜且標本量較少，很大程度上制約了NGS在診斷中樞神經系統感染性疾病的準確性。腦膿腫或局限于腦實質中的感染性疾病，進入腦脊液中的病原菌不多，甚至需取腦組織進行檢測［15］。腦組織取材更為復雜，因此NGS 技術對此類疾病的診斷有很大幫助。必須注意的是取材過程中須嚴格執行無菌操作，若標本被環境中的微生物污染將會影響NGS的檢出率。

4.2 敏感性有待提高NGS技術雖然在檢測罕見病原體方面有很強靈敏度，但報道稱在部分結核分枝桿菌、隱球菌等病原體的檢出率不如經典檢測方法，已確診中樞神經系統感染性疾病的5 例患者，運用NGS測序后并沒有檢出感染病原體［34］。結核分枝桿菌目前主要檢測方法是傳統培養、涂片，結核菌γ干擾素釋放試驗及PCR，其中傳統培養檢測方法為診斷結核性腦膜炎的“金標準”［2，35］，但培養周期較長。文獻報道結核菌γ干擾素釋放試驗診斷結核分枝桿菌敏感度高于70%，PCR 技術診斷結核性腦膜炎敏感度為59.5%［15］。周睍等［36］對確診為結核性腦膜炎的19 例病例腦脊液進行測序，診斷的敏感度為57.9%。《宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識》中建議［7］：對于結核分枝桿菌、軍團菌、布魯菌等胞內菌或厚壁菌即使檢出序列不高，也要考慮此類病原菌感染的可能。目前階段NGS技術對于胞內菌及厚壁菌檢出率不高，是由于此類細菌的核酸有厚莢膜或不易從腦脊液中被提取出來，如何有效提取此類細菌的核酸是影響NGS敏感度的重大阻礙［37］。

4.3 腦脊液病原菌特異度有待提高Glaser等［27］研究發現，在腦脊液NGS 測序結果中存在一些常見的細菌序列，如丙酸痤瘡桿菌、不動桿菌等。由于標本取材的特殊性，腦脊液或腦組織標本一直存在環境或標本中有被微生物污染的風險，一旦微生物混入其中就會導致檢驗結果出現一些無法解釋的序列，所以必須提高取材人員以及實驗室檢測人員的技術并優化實驗步驟［37］。

4.4 數據組文庫仍需進一步擴充統計顯示目前已經納入NGS基因文庫的病原體有8 000多種，其中包括3 000余種細菌，4 000余種病毒，200余種真菌和140種寄生蟲［7］。由于NGS技術問世時間尚短，目前仍有很多微生物尚未被人類發現，因此必須進一步擴充基因組文庫。隨著更多罕見或未知病原體的發現，可以更全面地分析NGS 結果。另外NGS 平臺較多，采取的標準及數據庫差異較大，因此需要構建出統一的數據庫標準，從而縮小不同平臺間數據庫之間的差距。這將有助于新發感染性疾病的快速診斷，以及更好的評價菌株分型和耐藥基因型，從而為臨床診治工作提供更好幫助。

5 NGS技術的前景

目前世界步入百年未有之大變局，新型冠狀病毒疫情暴發加速這一大變局，人們開始越來越重視感染性疾病。傳統的微生物檢測方法雖然技術成熟且穩定，但存在檢測周期長且操作復雜的缺陷。當今全球感染性疾病爆發大環境之下，傳統檢測技術的不足愈發明顯，在疾病的防治過程之中，準確、快速的診斷至關重要。統計資料顯示2016—2020 年，傳染病報告死亡數逐年上升，2016 年死亡數為18 237 例［37］，2020 年死亡數為26 374 例。中國感染性疾病的診療水平在世界上屬偏低，且與發達國家之間仍有很大差距，快速檢驗技術的廣泛應用有希望縮小我們與發達國家之間的差距。NGS技術作為一種新興的檢測技術，還有很大探索空間，其不需要分離培養且有準確性好的特點。NGS 技術的廣泛應用，將會優化檢測步驟并且制定一套規范化的檢驗流程，從而提高病原體的檢出率。相信隨著技術的進一步發展，NGS的成本會越來越低，同時也會越來越普及。

NGS技術在中樞神經系統感染性疾病的診斷中有極大的發展前景，其高通量、準確性高的特點可以彌補傳統病原體檢測方法的不足。但該技術步入臨床時間較短，仍有較大的發展空間，針對一些特定病原體檢出率不高，其檢測成本仍然較高。臨床工作中，仍需將臨床表現、影像學檢查、傳統實驗室檢測方法與NGS相結合，進行綜合分析［36］。

隨著人們對基因體信息認識的進一步提高，技術的革新以及文庫不斷的擴充，NGS 技術將在臨床中發揮更大的作用，尤其是當大量的數據被挖掘后，有可能發現一些顛覆傳統認知的發現。因此，現階段進行多中心大樣本的NGS 研究很有必要，不僅能夠推動抗生素精準治療以及加深人們對感染性病原體的認識，還可以使患者能夠得到更及時、更準確治療。相信在不久的將來，NGS 技術將成為臨床中診斷感染性疾病的有利工具。