GM-CSF在神經退行性疾病炎性反應過程中的作用

李嫚芹 張如意

湖北科技學院醫學部藥學院湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北咸寧 437100

神經退行性疾病是由于神經元和（或）其髓鞘的損失所導致的，隨著時間的推移和惡化，會引發多種功能障礙并誘發多種神經性疾病，主要包括阿爾茨海默病（Alzheimer 's disease，AD）、帕金森病（Parkinson's disease，PD）、多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）等疾病。隨著老齡化趨勢的逐漸增加，神經退行性疾病的發生率也逐漸增加，因此，目前尋找有效預防和治療手段和明確其相關機制已經成為全國當下的熱點問題。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因 子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）是一種與炎癥相關的細胞因子，在參與中樞神經系統炎癥方面起到關鍵作用，因此，本文通過對GM-CSF 的生物學特性和其在神經退行性疾病的神經炎癥方面進行綜述，為GM-CSF治療中樞神經系統疾病提供新思路。

1 GM-CSF及生物學特性

GM-CSF 是一種蛋白質，其分子結構由一個單鏈多肽組成。它是由144 個氨基酸殘基組成的多肽鏈，具有一個信號肽序列和一個成熟肽序列［1］。成熟的GM-CSF 多肽鏈的分子量為14～18 kD，其三維結構呈現出典型的細胞因子家族特征，包括一個穩定的α螺旋和β折疊結構。GM-CSF 的多肽鏈通過二硫鍵連接形成穩定的空間構型。該多肽鏈具有結構域，其中包含與受體結合和信號傳遞相關的關鍵氨基酸殘基。這些殘基位于分子的特定區域，與受體結合并介導細胞信號的轉導。GM-CSF 的分子結構對其與細胞受體的結合和活性發揮至關重要的作用。通過與相應的受體結合，GM-CSF 能夠啟動細胞內信號傳導通路，進而調控細胞增殖、分化和功能。需要注意的是，GM-CSF 存在多種結構變體和糖基化形式，這些變體可能在不同組織和疾病狀態下表達。此外，研究發現這種結構的多樣性可能對其生物活性和受體親和性產生影響，并在特定生理和病理過程中發揮不同的作用［2］。GM-CSF 分子在Leu-23、Asp-27 和Glu-39 上包含兩個分子內二硫鍵和三個環糖基化位點［3］，可刺激中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞的未成熟細胞和成熟細胞的增殖、分化、存活和功能［4］。同時，GM-CSF 在炎癥過程中發揮著重要作用，它能夠吸引和激活免疫細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和嗜中性粒細胞等，增強其炎癥反應能力，現在也被確定為一種神經元生長因子［5］。此外，GM-CSF 還具有免疫調節和組織修復作用等。總的來說，GM-CSF 在調節免疫應答、炎癥反應和組織修復中發揮重要作用。它對造血細胞的增殖和分化、免疫細胞的激活和功能增強起到關鍵的調控作用。

2 GM-CSF是神經退行性病變的共同炎性分子

炎癥是中樞神經系統（central nervous system，CNS）和外周復雜的多因素過程，其活動在不同疾病分期中存在差異。神經炎癥通常涉及中樞神經系統駐留細胞和外周免疫細胞之間復雜的相互作用，包括細胞因子、趨化因子和其他促進細胞-細胞通信的可溶性因子的釋放［6］。小膠質細胞是中樞神經系統內的免疫細胞，起源于胚胎早期未成熟的卵黃囊祖細胞。根據不同疾病階段的炎癥環境，小膠質細胞可以通過改變它們的形態、基因表達和功能來分化為不同的表型。此外，根據它們的分子特征，小膠質細胞不僅能夠觸發神經毒性通路導致進行性神經退行性變，還能在促進神經保護、下調炎癥和刺激修復方面發揮重要作用［7］。作為中樞神經系統免疫細胞，小膠質細胞已成為許多疾病的細胞靶點，包括AD、PD、MS 和其他神經炎癥/神經退行性疾病等［8］。越來越多的證據表明，其他細胞如星形膠質細胞、神經元、少突膠質細胞和周細胞也在其中扮演著重要的角色［9］。GM-CSF 是一種單體糖蛋白，由活化的血管內皮細胞分泌。它具備造血因子和炎癥細胞因子的特性，并廣泛表達于多種細胞中，包括T 細胞、單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞。引人注目的是，Th 細胞中誘導GM-CSF 表達，獨立于任何外源性刺激或抗原，導致自發性CNS 炎癥伴有神經功能缺損［10］。此外，GM-CSF 能夠刺激和增強免疫細胞的活性，包括巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突狀細胞等。單核細胞是髓系細胞，在組織穩態和炎癥中發揮重要作用。這是因為單核細胞可以對多種淋巴細胞來源的細胞因子產生特異性反應，其中包括細胞刺激因子（colony stimulating factors，CSFs）。效應性T 細胞通過產生這些細胞因子來激活髓系細胞，而GM-CSF 能夠在單核細胞到達炎癥部位后，指導其分化和產生功能［11］。在神經退行性病變中，GM-CSF 的促炎作用導致免疫細胞的聚集和活化，進而引發炎性反應。GM-CSF 能夠促使免疫細胞產生和釋放多種炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）等［12］。這些細胞因子在炎性反應中起著重要的調節作用，進一步加劇神經退行性病變的炎性損傷。值得注意的是，GM-CSF 可以吸引和招募炎性免疫細胞，如巨噬細胞和嗜中性粒細胞，到達病變區域。這些細胞的浸潤進一步加劇炎癥反應，并對神經組織造成損傷。總之，GM-CSF 參與神經退行性病變炎性反應的機制主要涉及促炎作用、細胞因子釋放、炎性細胞浸潤以及氧化應激和炎性介質的產生。這些過程的共同作用導致炎性反應在神經退行性病變中的發展和進展［13］。

3 GM-CSF參與神經退行性疾病的炎癥反應

3.1 GM-CSF 與阿爾茨海默病阿爾茨海默病是一種遲發性、進行性神經退行性疾病，其特征是突觸和神經元的喪失，導致認知能力衰退、記憶障礙甚至死亡［14］。神經炎斑塊（neuritic plaques，NP）由不溶性、聚合淀粉樣蛋白（agregated beta-amyloid，A β）肽和由過度磷酸化Tau 蛋白組成的神經纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFT）被認為是AD 的神經病理學特征［15］。AD 的發病機制涉及多種途徑，這些途徑包括突觸衰竭、線粒體氧化損傷和炎癥反應，研究報道，在這些細胞變化中，炎癥反應是AD 發病機制的關鍵因素。炎癥是由反應性星形膠質細胞和小膠質細胞的增殖引起的，小膠質細胞可通過作為抗原提呈細胞來激活T 淋巴細胞，并通過產生促炎細胞因子，如GM-CSF，從而參與炎癥反應［16］。GM-CSF 是一種促炎細胞因子，參與調節粒細胞巨噬細胞群體的增殖、分化和功能活性［17］。GM-CSF 灌注到大腦中會引起一種顯著的局部反應，其特征是大量小膠質細胞的增殖。

為了研究GM-CSF 在小膠質細胞激活以及對神經元存活、興奮性和突觸傳遞的影響，研究人員進行了一項實驗。他們通過研究慢性GM-CSF 持續作用72 h 對雄性大鼠海馬切片培養（原位）中小膠質細胞的影響，運用了局部場電位的細胞外電生理記錄、免疫組織化學、基于設計的體視學、生化分析以及小膠質細胞的藥理消融等實驗方法。研究顯示，GM-CSF 濃度為100 μg/L，作用時間為72 h，小膠質細胞數量增加了1.95 倍，并且在體外和原位條件下均表現出顯著的有絲分裂作用。這些發現表明GM-CSF 對小膠質細胞的激活至關重要，抗GM-CSF 抗體可以抑制中樞神經系統中的小膠質細胞活性［18］。

血-腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是一種高度專門化的結構和生化屏障，調節血源性分子進入大腦，并在大腦微環境中保持離子穩態。大腦內皮細胞之間的連接復合物，包括緊密連接和黏附連接，主要決定了BBB 的特性［19］。BBB 功能受損會使神經元、神經膠質與炎癥細胞相互關聯［20］。GM-CSF 是一種能夠穿過BBB，且也在大腦中產生的細胞因子，在大腦中多種細胞表達GM-CSF 受體，包括神經元、少突膠質細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞和內皮細胞［21］。研究表明，腦實質和腦脊液中高GM-CSF 水平誘導BBB 開放，促進外周血單核細胞穿過BBB 進入大腦。同時為了研究GM-CSF 是否可以阻斷單核細胞的浸潤，通過在APP/PS1 阿爾茨海默病模型小鼠中進行研究，結果發現GM-CSF 能通過轉錄調節下調閉塞帶-1 蛋白（ZO-1）表達，通過泛素化途徑下調Claudin-5 表達，觸發人腦微血管內皮細胞單層緊密連接分解，所以腦內GM-CSF 阻斷可消除APP/PS1 阿爾茨海默病模型小鼠大腦中增加的單核細胞浸潤。因此，單核細胞浸潤在AD 的發病機制中發揮重要作用［22］。研究顯示在體外也證實了AD 患者血液單核細胞對細胞因子分泌的改變。全身免疫反應的改變可以解釋AD 患者感染性并發癥發生率的增加。

眾所周知，AD 的標志之一是腦實質中淀粉樣蛋白斑塊的積累。有研究表明，在AD 動物模型中，CD40/CD40L 相互作用導致HEK/APPsw/CD40 細胞中淀粉樣蛋白水平的增加，以及AD 動物模型中淀粉樣蛋白病理的增加。考慮到CD40L 刺激也被證明會增加GM-CSF，Volmar 等［23］檢測了HEK/APPsw/CD40 細胞中GM-CSF 的表達，發現在CD40L刺激的細胞中，GM-CSF 的表達比基礎產量增加了5.8 倍。為了進一步研究CD40L 后淀粉樣蛋白的增加是否由GM-CSF 介導，采用中和抗體阻斷了GM-CSF 的功能，從而導致CD40L 刺激后淀粉樣蛋白產生的減弱，結果發現，GM-CSF 在CD40L/CD40相互作用的下游起作用，GM-CSF 可能是CD40L/CD40 信號通路誘導抗體產生的關鍵成分。

值得注意的是，Treg 數量和功能的減少與AD進展密切相關。隨后研究發現GM-CSF 治療誘導了在周圍評估的Treg 頻率且外源性GM-CSF 可以很容易地橫向穿過血腦屏障的BBB。為了證實這一發現，Kiyota 等［24］在2018 年通過在AD 小鼠海馬內注射GM-CSF，結果發現挽救了AD 小鼠的認知能力下降，增加了淀粉樣蛋白斑塊鄰近小膠質細胞的數量，并通過增強Aβ40 從大腦向外周循環的外排減少淀粉樣蛋白低聚物。此外，還提供了GM-CSF 介導的挽救AD 小鼠海馬內幾種神經病理學表現的證據。最后，作為一種免疫調節劑，GM-CSF 糾正了AD 小鼠外周血Treg 頻率的缺陷到非Treg 小鼠的水平。總之，這些數據表明GM-CSF通過多效性機制提供的神經保護，包括免疫調節、突觸可塑性和神經發生，從而在AD 中獲得有益的結果。

3.2 GM-CSF 與帕金森病PD 是一種以運動遲緩、僵硬和休息性震顫為特征的神經退行性疾病［25］。其特征是多巴胺能（dopaminergic acid，DA）神經元的丟失和含有α-突觸核素的路易小體的存在［26］。非結構的α-突觸核蛋白形成不溶性原纖維和聚集物，導致PD 中活性氧的增加和細胞毒性。大量證據表明，小膠質細胞活化、核因子kappa B（neclear factor kappa B，NF-κB）誘導的神經炎癥和炎癥因子的釋放可能在PD 的神經退行性變中起重要作用，并且神經炎癥在PD 中是以“朊病毒樣”的方式在錯誤折疊的α-突觸核蛋白的傳播中發揮關鍵作用［27］。在中樞神經系統中，GM-CSF 由星形膠質細胞和T 細胞產生，可以穿過BBB 和血-脊髓屏障，在那里它與免疫細胞和神經細胞上的受體接觸，已被證明有神經保護作用。GM-CSF 的神經保護活性被認為與其對促炎反應和抗炎反應的作用有關［28］。

CD4+T 細胞效應細胞向調節細胞的轉化已被證明在神經退行性疾病的發生和進展過程中通過恢復免疫平衡來減緩疾病進展。調節性T 細胞（regulatory T cells，Treg）頻率和功能的增加與靜息小膠質細胞表型、黑質紋狀體神經保護以及腦組織免疫穩態的恢復有關［29］。恢復Treg 的數量和功能是一種新的治療神經退行性疾病的治療策略。無論Treg 的功能是通過過繼細胞轉移、藥物還是免疫調節劑來增強的，最終的結果都是一個強大的抗炎和神經元保留反應［30］。GM-CSF 是一種已知的免疫調節劑，可誘導調節性T 細胞，并在廣泛的神經退行性疾病中作為神經元保護劑。Olson等［31］通過在1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氫吡啶（MPTP）中毒小鼠中評估了GM-CSF 的神經保護和抗炎能力，結果表明GM-CSF 治療具有抗炎能力和誘導Treg 群體的能力，其治療有可能改變神經炎癥疾病。有證據表明，炎癥性小膠質細胞反應參與了PD 和該疾病的動物模型中多巴胺能神經元死亡的病理生理學過程。Henze 等［32］通過利用神經元/膠質中腦培養的體外模型，我們發現多巴胺能神經毒素1-methyl-4-phenylpyridinium（MPP+）刺激小膠質細胞的增殖，選擇性地降低DA 神經元的存活，MPP+細胞處理后的小膠質細胞增殖被GM-CSF 模擬，GM-CSF 是星形膠質細胞產生的促炎細胞因子，并被GM-CSF 的中和抗體阻斷。因此，研究結果表明，一種星形膠質細胞因子GM-CSF 能夠介導MPP+對小膠質細胞的增殖作用。由于T 細胞很少表達GM-CSF 受體，因此需要中介體來影響Treg 的功能。幾種可能的中間細胞類型包括樹突狀細胞、巨噬細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞或髓系來源的抑制細胞等。基于支持耐受性樹突狀細胞調節Treg 活性的數據，Schutt 等［33］選擇首先研究GM-CSF 對樹突狀細胞對抗神經炎癥和保護多巴胺能神經元的作用，還評估了在PD 中被氧化修飾和（或）錯誤折疊的蛋白質，如N-α-Syn。數據表明樹突狀細胞在調節炎癥和隨后的神經退行性變中發揮了關鍵的作用，GM-CSF 能導致Treg 和Treg 活性的增加，為減少自身免疫或神經退行性疾病的神經炎癥提供了一種有吸引力的治療策略。為了更好地了解GM-CSF 對PD 中多巴胺能神經元的保護作用，Kim 等［34］研究了GM-CSF 對小鼠PD 模型中多巴胺神經元存活和運動行為改變的影響和GM-CSF對MPP+處理的PC12 細胞以及胚胎小鼠原代中腦神經元（primary mesencephalic neurons，PMNs）的體外神經保護作用。結果表明，GM-CSF 顯著降低了MPP+誘導的PC12 細胞和PMNs 的多巴胺能細胞死亡。GM-CSF 在體外調節凋亡相關蛋白Bcl-2 和Bax的表達。此外，在體內給予GM-CSF 7 d，可保護黑質多巴胺能神經元，并改善PD 小鼠的運動行為。

免疫轉化在PD 中的潛在治療作用源于十多年的動物研究，為了將這些結果與人類疾病聯系起來，Gendelman 等［35］進行了一項隨機、安慰劑對照的雙盲1 期試驗，使用了一種研究充分的免疫調節劑GM-CSF，招募了17 名年齡匹配的非帕金森病受試者作為未接受治療的對照組和20 名帕金森病患者，對帕金森病患者和對照組均進行了為期2 個月的基線分析監測，結果表明，與安慰劑相比，PD 評分量表在治療6 周和8 周后表現出適度的改善，與經過預處理的PD 患者和非PD 對照組相比，與腦磁圖記錄的皮質運動活動和Treg 數量和功能的改善相平行，所以使用免疫療法，如GM-CSF，調節免疫系統，誘導Treg 增加其功能，抑制神經炎癥和蛋白質錯誤折疊，以更好地提供神經保護和治療結果。

3.3 GM-CSF與多發性硬化癥MS是一種復雜的、炎癥性的、脫髓鞘的中樞神經系統髓鞘疾病［36］，由先天免疫系統和適應性免疫系統的細胞介導，特別是T淋巴細胞［37］。T細胞進入大腦后，與小膠質細胞和星形膠質細胞相互作用，并招募單核細胞和巨噬細胞，它們在啟動和維持導致中樞神經系統損傷的炎癥環境中發揮關鍵作用［38］。GM-CSF 是由骨髓來源的細胞產生的，如T細胞和單核/巨噬細胞，被證明作為促激活和分化因子作用于成熟的髓系細胞，在自身免疫性和炎癥性疾病的發展中發揮關鍵作用［39］。因此，T 淋巴細胞通過產生的GM-CSF 作用于髓系細胞，從而引發中樞神經系統炎癥［40］。

GM-CSF 作為MS 病理生理學必要的中介物的新作用得到疾病發病機制的免疫調節和神經免疫方面的支持。許多研究表明GM-CSF 在MS 中發揮作用，包括BBB 破壞、脫髓鞘和神經退行性變。為了證實這一觀點，Imitola 等［38］通過采用MS 患者的腦組織，使用蘇木精和伊紅染色（Haematoxylin &Eosin staining，HE）和熒光快速藍染色（luxol-fast blue staining，LFB）檢測了MS 斑塊的炎癥和脫髓鞘，同時，通過檢測額外的MS 大腦，證實了T 細胞產生GM-CSF 的情況，這表明GM-CSF 與MS 的發病機制相關。BBB 的破壞已被認為是MS 發病機制中的一個過程，推測GM-CSF 可能對單核細胞遷移產生重要影響。GM-CSF 刺激的單核細胞增加了TNF-α的產生，TNF-α可以通過增強內皮黏附分子表達來介導BBB 的破壞。此外，GM-CSF 誘導單核細胞中趨化因子受體的表達，使它們能夠獲得炎癥表型并選擇性地穿過BBB。除這些間接作用外，GM-CSF 還可以通過改變緊密連接蛋白的表達直接影響BBB 的通透性，緊密連接蛋白可以結合鄰近的腦微血管內皮細胞的細胞膜，調節細胞通過BBB 的遷移。GM-CSF 介導的緊密連接的機制包括ZO-1 和Claudin-5 的表達減少，從而直接導致腦內皮細胞通透性的增加。在蛋白水平和mRNA水平上均發現了ZO-1 的下調，表明GM-CSF 抑制了ZO-1 的轉錄。

GM-CSF 還被發現能刺激星形膠質細胞的增殖，導致星形細胞增多，這是MS 的一個重要特征［41］。星形膠質細胞是豐富的中樞神經系統駐留細胞，在健康和疾病中具有重要的功能。星形膠質細胞的功能受小膠質細胞、微生物組和環境提供的因素的控制［42］。在MS 中，GM-CSF 誘導小膠質細胞的增殖和激活，這是該疾病發生所必需的［43］。研究MS 病理特征的最常用的動物模型是實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）。EAE 是研究多發性硬化癥特定方面的有用模型，如免疫細胞激活和功能、中樞神經系統炎癥和自身免疫，以及脫髓鞘、再髓鞘形成和神經退行性變的機制［44］。因此，Wheeler 等［42］通過對細胞在MS 及其臨床前模型實驗性自身免疫性腦骨髓炎通過單細胞RNA測序結合細胞特異性核糖體RNA 分析，結果顯示，在EAE 和MS 中發現了星形膠質細胞。為了進一步研究GM-CSF 信號通路的影響，我們在存在或不存在GM-CSF 的情況下，在體外增加IL-1β和TNF劑量激活原代小鼠星形膠質細胞，結果發現GM-CSF 以劑量依賴性的方式促進了促炎基因的表達。IFN-b 是一種廣泛應用于MS 的治療方法，但其疾病調節機制尚不清楚。Rasouli 等［45］通過檢測MS 患者的外周血，進行了體內和體外實驗，結果發現，與接受IFN-b 治療的患者和健康對照組相比，未經治療的MS 患者的外周血中產生GM-CSF的CD4+和CD8+T 細胞的數量顯著增加。與體外分析一致，IFN-b 在體外抑制T 細胞產生GM-CSF。通過對EAE 模型的研究，我們可以發現GM-CSF 促進單核細胞通過BBB 的遷移，并誘導小膠質細胞的增殖和激活，小膠質細胞進而分泌促炎癥細胞因子維持炎癥環境［46］。

4 總結與展望

GM-CSF 在神經退行性疾病的炎性反應過程中的作用一直是研究的熱點之一，在神經退行性疾病中，炎癥反映在促進神經損傷和疾病進展中起重要作用。GM-CSF 被認為參與調節炎性介質的釋放和免疫細胞的活化，從而影響炎癥介導的神經損傷過程。GM-CSF 可影響免疫細胞的功能，如巨噬細胞、樹突狀細胞和T細胞等。這些免疫細胞在神經退行性疾病的炎性反應中發揮重要作用。GM-CSF 的作用可能包括促進免疫細胞的增殖和活化，調節炎癥介質的釋放和細胞遷移等，從而調節炎性反應的程度和持續性。GM-CSF還具有神經保護作用，有助于減輕神經細胞的損傷和喪失。GM-CSF 可促進神經細胞的生存和功能維持，減少神經退行性疾病的發展。這一作用機制可能涉及調節神經細胞的免疫反應、抗氧化應激和促進修復過程等。基于GM-CSF在神經退行性疾病炎性反應中的作用，一些研究探索了利用GM-CSF 作為潛在的治療策略。如通過給予外源性的GM-CSF 調節炎性反應、促進神經細胞的保護和修復。此外，也有研究探討了利用GM-CSF的類似物或改良型的GM-CSF 增強其治療效果。盡管GM-CSF 在神經退行性疾病炎性反應中的作用已經得到一定程度的研究，但仍有許多未知的細節和機制值得繼續探討。