烏鱧p65基因克隆及表達分析

摘要 為探究烏鱧p65基因在機體中免疫應答的作用，本研究克隆烏鱧p65基因（Cap65）的開放閱讀框（ORF），推導Cap65序列進行生物信息學分析，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）分析其在各組織的分布及諾卡氏菌感染后的表達模式，探究p65基因在魚類免疫應答中的作用機制，為研究該基因在魚類免疫上的作用提供參考。

關鍵詞 烏鱧；p65；組織分布；免疫應答

中圖分類號 S917.4；S9-9 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）21-0067-06

魚類諾卡氏菌病是由諾卡氏菌引起，該致病菌廣泛分布于水中，主要感染魚類的脾臟、肝臟、體腎和頭腎，并在免疫器官表面形成白色結節[1]。20世紀60年代，學者從海水魚紅大麻哈魚中分離鑒定了星狀諾卡氏菌（Nocardia asteroides）[2]。迄今為止，在多種魚類中相繼分離到諾卡氏菌，諾卡氏菌主要分為3種不同類型，分別是星狀諾卡氏菌（N. asteroides）[3]、殺鮭諾卡氏菌（N. salmonicida）[4]和鰤魚諾卡氏菌（N. seriolae）[5]。其中鰤魚諾卡氏菌（N. seriolae）是一種革蘭氏陽性分支絲狀菌，為魚類諾卡氏菌病的主要病原。現有研究發現，鰤魚諾卡氏菌是一種條件致病菌，只有適合條件下才會感染魚類[1]。該菌可以通過魚鰓或傷口感染魚體，其發病周期長，感染率和死亡率均較高，給水產養殖業帶來了極大經濟損失[6]。

烏鱧（Channa argus），隸屬于鱧科鱧屬，又叫烏魚、俗稱黑魚，具有較高的藥用價值，同時其肉味鮮美、營養豐富，深受消費者熱愛[7]，在我國廣東、安徽和福建等地區廣泛養殖。烏鱧性格兇猛、喜集群、好斗，經常出現皮膚潰爛的情況，易感染諾卡氏菌。研究發現，烏鱧感染諾卡氏菌后，前期出現反應遲鈍、食欲下降、體表潰瘍等癥狀，后期在其鰓絲或內臟組織中形成白色結節，易導致其大量死亡[1]。

p65基因又被稱為RelA，是構成核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）家族成分之一，其與RelB、c-Rel、裂解蛋白NF-κB 1（p50）與NF-κB 2（p52）構成NF-κB炎性信號通路，同時，p65能夠和p50形成異源二聚體在NF-κB信號通路中傳導信號，且廣泛存在于大多數細胞中[8]。研究發現，p65、RelB和c-Rel可通過位于N末端內的Rel同源結構域進行表征，而且這些同源結構域須與位于C末端內的反式激活域相結合[9]。而NF-κB 1和NF-κB 2可由大型前體NF-κB前體蛋白（p105和p100）進入p50和p52亞基，介導激活NF-κB信號通路[10]。研究發現，p65可以通過多種刺激激活NF-κB信號通路，刺激包括自由基氧化、紫外線輻射（UV）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素1-beta（IL-1β）、病原體相關分子模式（PAMPs）或細菌脂多糖（LPS）[11]。目前有關p65的研究主要集中在哺乳動物，在魚類中相關研究較少。本研究克隆烏鱧p65基因（Cap65）的開放閱讀框（ORF），推導Cap65序列進行生物信息學分析，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）分析其在各組織的分布及諾卡氏菌感染后的表達模式，進一步探究p65基因在魚類免疫應答中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

從廣東省中山市某養殖廠采集的健康烏鱧（200±10 g/尾）。諾卡氏菌為前期從患病烏鱧病灶部位分離純化、并于-80 ℃進行低溫保藏的菌種。試驗所用常規試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取及cDNA反轉錄試劑盒，DNA凝膠回收純化試劑盒和qPCR相關試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Cap65基因ORF擴增" 參考宋長江等[12]的方法，按照全式基因RNA試劑盒說明書操作，提取烏鱧總RNA，隨后使用cDNA反轉錄試劑盒進行反轉錄。根據NCBI上已知烏鱧基因組信息，設計克隆Cap65基因ORF序列的引物Cap65-F和Cap65-R，隨后將PCR產物連接到pMD18T載體上，轉入Trans5α感受態細胞，挑取陽性克隆，送由廣州生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 Cap65基因序列分析" 用生物學軟件（Bioedit 7.0、DNAMANV6和DNAstar等）對Cap65測序結果進行序列拼接，并將拼接結果進行比對。參考宋長江等[12]的方法，利用生物信息學網站在線分析Cap65氨基酸理化性質、涉及的通路、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位及三維結構構建。在NCBI上下載與Cap65氨基酸相似其他物種p65序列，利用MEGA 5.0.3對這些氨基酸序列進行系統進化分析。

1.2.3 Cap65基因組織表達" 取3尾健康活力較好的烏鱧，無菌條件下解剖取其肝臟、脾臟、頭腎、腸道、皮膚以及血液等10個組織，放入RNAlater暫存，按照全式基因RNA試劑盒說明書方法提取烏鱧總RNA，并立即反轉錄成cDNA。根據Cap65基因序列，利用Primer 5.0軟件設計熒光定量引物qCap65-F和qCap65-R（表1），使用qTower 3.0熒光定量儀進行qRT-PCR反應，程序設置參考汪志文等[13]的方法。每個樣品重復檢測3次。qRT-PCR以β-actin基因為內參基因（表1），用2–??Ct法來計算相對表達量，采用GraphPad Prism 9數據分析軟件分析數據之間的顯著性。

1.2.4 諾卡氏菌刺激后Cap65基因的組織表達" 隨機選取120尾健康烏鱧，平均分成2組，每組60尾。其中一組腹腔注射0.1 mL諾卡氏菌（1×105 CFU/mL，重懸于無菌PBS），另一組腹腔注射相同量無菌PBS。分別在注射后0、3、6、12、24、72、120和168 h各取試驗組和對照組的烏鱧3尾，剖取腸道、脾臟、頭腎和體腎組織，放入2.0 mL無RNase酶離心管中，將組織完全浸泡于TransZol Up，在-80 ℃下保存。根據上述1.2.1方法提取RNA和合成cDNA。

2 結果與分析

2.1 烏鱧p65基因的克隆

根據NCBI數據庫已公布的烏鱧p65基因ORF設計引物，以烏鱧肝臟組織cDNA為模板進行PCR擴增，將獲得產物與pMD-18T進行連接轉化，最終將陽性克隆送公司測序，分析判斷該擴增產物為烏鱧p65基因，ORF為1 884 bp，可編碼627個氨基酸。

2.2 烏鱧p65基因生物信息學分析

2.2.1 p65氨基酸序列理化性質" ProtParam在線分析結果表明，烏鱧p65蛋白理論分子量為69.43 ku，理論等電點為5.86。同時，其氨基酸序列中含量最低的氨基酸為色氨酸（Trp，0.8%）；含量最高的氨基酸為絲氨酸（Ser，10.5%）。其中帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）有69個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）有57個；不穩定系數為45.60，較為穩定。最后，通過ProtScale分析（圖1）該蛋白親疏水性，發現其結果與ProtParam分析結果一致，烏鱧p65蛋白為親水性蛋白。

通過Signal IP 4.1 Server預測該序列的信號肽（圖2），結果顯示并沒有信號肽序列，為胞外蛋白。利用TMHMM Server 2.0預測顯示該蛋白無跨膜結構域。經由生物信息學在線預測發現，該序列N-糖基化位點6個，糖胺聚糖附著位點1個，cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點2個，蛋白激酶C磷酸化位點11個，酪蛋白激酶II磷酸化位點6個，N-豆蔻?；稽c6個，丙烯基結合位點（CAAX box）2個，C末端定位信號序列微體7個，NF-kappa-B/Rel/背側結構域（F-R-Y-x-C-E-G）1個。亞細胞定位分析發現該蛋白主要存在于線粒體中。

2.2.2 p65的高級結構和保守結構域預測" 通過SOPMA分析烏鱧p65蛋白的二級結構，發現該蛋白二級結構中由107個氨基酸組成延伸鏈（Extended strand），占17.07%；由110個氨基酸組成α螺旋（Alpha helix），占17.54%，β折疊占4.15%（圖3）。利用SWISS-MODLE在線構建蛋白質三級結構結果如圖4。

2.2.3 烏鱧p65同源性及進化分析" 通過與NCBI上已發布的p65氨基酸進行序列比對，發現烏鱧p65與它們的相似度為50.91%～79.36%，其中與翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）相似度最高，高達79.36%。使用ClustalW與MEGA 5.3.2軟件將烏鱧p65與其他物種的p65根據N-J鄰近法構建系統進化樹（圖5），發現S. chuatsi聚為一支，統歸于魚類。

隨后使用GENEDOC軟件將烏鱧與NCBI上已公布物種的p65氨基酸進行多重序列比對，結果發現在烏鱧p65氨基酸序列中存在一個RHD（55-223 aa）結構域和一個IPT結構域（223-291 aa）。

2.3 烏鱧p65基因的組織分布

使用qTower 3.0熒光定量儀進行qRT-PCR分析，檢測健康烏鱧各組織p65基因的表達量，由圖6可知，烏鱧p65基因在所檢測10個組織中均有表達，在腦中表達量最高，肝臟、脾臟、血液以及頭腎等組織中表達量較少，在肌肉組織中表達量最少。

2.4 N. seriolae感染后烏鱧p65在不同組織中的表達模式

為分析細菌感染對烏鱧p65基因表達影響，本研究選取烏鱧血液、脾臟、頭腎和肝臟4個免疫器官的組織，并通過檢測烏鱧在感染N. seriolae后不同時間點（3、6、12、24、72、120和168 h）p65基因表達變化，分析該基因在烏鱧免疫應答過程中的作用。由圖7可知，烏鱧在感染N. seriolae后，p65基因在血液、脾臟、頭腎和肝臟這4個組織中均有表達。隨著時間推移，在脾臟中p65基因呈現先上升后下降變化趨勢，具有時間依賴性。而在血液中，僅在感染N. seriolae 6 h后，烏鱧p65基因發生顯著性上調。在肝臟和頭腎中，烏鱧p65基因相對表達量在感染24 h時呈現顯著上調。

3 結論與討論

3.1 烏鱧p65基因的結構特征

本研究克隆的烏鱧p65基因ORF為1 884 bp，可編碼627個氨基酸，包含有一個RHD（55-223 aa）結構域和一個IPT結構域（223-291 aa）。已在多種魚類中克隆并鑒定到p65基因，其中卵形鯧鲹（Trachinotus Ovatus）[14]p65的ORF為1 866 bp，編碼621個氨基酸；牙鲆（Paralichthys olivacaus）[15]p65的ORF為1 914 bp，編碼626個氨基酸；鱖魚（Siniperca chuatsi）[16]p65的ORF為1 914 bp，編碼637個氨基酸；鯉魚（Cyprinus carpio）[17]p65的ORF為1 662 bp，編碼553個氨基酸；草魚（Ctenopharyngodon idella）[17]p65的ORF為1 833 bp，編碼610個氨基酸。綜合以上結果發現，p65基因在淡海水魚類中所編碼氨基酸序列長度差異不大，進化過程保守。隨后通過多序列比對以及構建系統進化樹發現，Cap65與其他魚類同源性較高，其中與鱖魚（Siniperca chuatsi）同源性最高，同其他魚類聚為一支。隨后對Cap65蛋白進行分析，發現該基因上存在RHD和IPT這2個保守結構域。以往研究表明，在野豬p65和草魚p65蛋白上還存在一個PDB結構域和一個TAD結構域，但是本研究中并未預測到，這表明PDB結構域和TAD結構域并不保守[14]。

3.2 烏鱧p65基因的組織表達模式

在健康烏鱧體內p65基因在腦中表達量最高，其次是肝臟，脾臟，血液以及頭腎等免疫組織，在肌肉組織中表達量最少。已有研究表明，在草魚（Ctenopharyngodon idella）[17]、大黃魚（Larimichthys crocea）[18]、鯉魚（Cyprinus carpio）[16]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[15]和卵形鯧鲹（Trachinotus Ovatus）[19]等魚類中，p65在免疫組織中表達量相對較高。與以往研究對比發現，p65基因在不同魚類不同組織中表達量不同，但是在免疫組織中相對表達量較高。這有可能是p65基因在非特異性免疫中具有一定功能，但是參與具體途徑及其作用機制尚不清楚，仍需進一步探索。

3.3 N. seriolae感染后烏鱧p65基因的組織表達變化

經過N. seriolae感染后的烏鱧，在脾臟、肝臟和頭腎這3個免疫組織中，烏鱧p65基因相對表達量在感染12、24 h時呈現顯著上調，這與脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后，卵形鯧鲹（Trachinotus Ovatus）、草魚（Ctenopharyngodon idella）和大黃魚（Larimichthys crocea）p65基因在脾臟、肝臟和頭腎組織中的表達模式相似。研究表明，LPS可以通過激活NF-κB通路，引起炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α和NO等的釋放，形成炎癥反應[17，19]。N. seriolae作為致病菌，具LPS相同的功能，而p65是NF-κB家族重要組成部分，因此該基因在機體受到感染后，免疫組織中的p65基因表達顯著上調，說明p65可能參與機體先天免疫應答。經過N. seriolae感染6 h后，Cap65基因在血液中表達顯著上調，這主要是由于血液是機體運輸養分的通道，通往各個組織，N. seriolae經由血液感染機體多個組織。

4 結語

烏鱧p65基因ORF為1 884 bp，可編碼627個氨基酸，包含有一個RHD（55-223 aa）結構域和一個IPT結構域（223-291 aa），在進化上相對保守，和其他脊椎動物具有相似的功能。N. seriolae感染后p65基因相對表達量均顯著上調，這表明p65基因參與烏鱧抗細菌感染的免疫應答過程。

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（責編：王 菁）