加州鱸Caspase-3基因克隆及表達分析

摘要 從加州鱸（Micropterus salmoides）頭腎組織中克隆獲得Caspase家族中Caspase-3基因的編碼區序列，通過生物信息學分析工具分析Caspase-3基因的蛋白結構，預測其功能并檢測其在加州鱸各組織中的表達量。結果表明，該基因cDNA全長890 bp，ORF為852 bp，可編碼283個氨基酸，蛋白理論分子質量為73.06 ku，理論等電點（PI）為5.09；Caspase-3基因含有一個保守信號肽序列，不存在跨膜區；多序列比對結果顯示加州鱸Caspase-3與紅笛鯛（Lutjanus peru）Caspase-3相似度最高，高達88.38%；系統進化分析發現加州鱸Caspase-3與紅笛鯛聚為一支；Caspase-3基因在所取組織中均有表達，在腦組織中表達量最高，在鰓組織中表達量最低。

關鍵詞 加州鱸；Caspase-3；生物信息學；組織表達分析

中圖分類號 S917.4；S9-9 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）21-0073-07

Cloning and expression analysis of Caspase-3 in Micropterus salmoides

LIANG Fu" " SONG Changjiang" " TANG Huaiqing" " QIU Jinzhu" " ZHAO Tianzhen

ZHENG Hansheng" " SONG Haixia*

（Zhongshan Institute for Quality and Safety Inspection of Agricultural Products， Zhongshan 528400， China）

Abstract The sequence of the coding region of Caspase-3 gene in Caspase family was obtained from the head and kidney tissue of Micropterus salmoides， and the protein structure and function of Caspase-3 gene was analyzed by bioinformatics analysis tools . The results showed that the cDNA of Caspase-3 was 890 bp， ORF was 852 bp， encoding 283 amino acids. The theoretical molecular mass was 73.06 ku， and the theoretical isoelectric point （PI） was 5.09. This gene contained a conserved signal peptide sequence without the transmembrane region. Multiple sequence alignment showed that the M. salmoides Caspase-3 met Lutjanus peru Caspase-3 up to 88.38%. Phylogenetic analysis found that M. salmoides Caspase-3 and L. peru cluster together. The Caspase-3 gene was expressed in the selected tissues， which was the highest in brain tissues and the lowest in gill tissues.

Keywords Micropterus salmoides; Caspase-3; bioinformatics; tissue expression analysis

加州鱸（Micropterus salmoides）又稱大口黑鱸，原產于美國，目前在我國沿海內陸地區廣泛養殖，是近年來我國主要養殖品種之一[1]。伴隨著養殖規模的擴大、養殖密度的增加以及養殖水體的惡化，加州鱸養殖病害頻繁暴發，致病病原種類繁多，大致可以歸為以下3類，分別是細菌類病原鰤魚諾卡氏菌（Nocardia seriolae）[2]、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）[3]、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）等，病毒類病原虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus）[4]、彈狀病毒（Rhabdoviridae）等，寄生蟲類病原纖毛蟲（Chlamydodontida）[5]等。

細胞凋亡是一種基本而復雜的生物學過程，使生物體能夠在發育、穩態和疾病期間殺死和去除不需要的細胞[6-7]。在所有參與細胞凋亡激活和執行的蛋白質中，半胱氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）在細胞凋亡過程中發揮至關重要的作用，迄今在人類中已鑒定出14種[8-9]。根據Caspase蛋白結構與功能可將其分為3類：Caspase-1、-4、-5和-13與炎癥反應相關；Caspase-2、-8、-9和-10是細胞凋亡啟動子；Caspase-3、-6和-7為細胞凋亡的執行者，直接介導細胞凋亡，其中Caspase-3是凋亡壞死細胞和凋亡細胞的關鍵介質[10]。細胞凋亡信號通路一般可分為內源性和外源性兩大類，外源性細胞凋亡由細胞表面死亡受體蛋白介導，而內源性細胞凋亡由源自細胞內的信號觸發，外源性和內源性細胞凋亡途徑都會導致Caspase-3的活化。研究表明，Caspase-3還與人類腫瘤形成以及神經性疾病有關，如亨廷頓病和阿爾茲海默病[11]，此外，它還具有非凋亡功能，如參與機體組織分化和再生等[12]。Fernando等[13]研究表明，Caspase-3不僅參與細胞凋亡，還參與神經干細胞的分化。另有研究發現Caspase-3參與蠅精子細胞的個體分化過程[14]。Caspase-3在不同物種上發揮的主要功能仍需探索，目前已在部分魚類中研究了Caspase-3，但Caspase-3在魚類免疫中的定位尚不明確。本研究克隆了加州鱸Caspase-3基因開放閱讀框（ORF），對該基因序列進行生物信息學分析，分析其基因結構，預測其蛋白功能，并檢測該基因在各組織中的分布，研究結果將為后續深入研究加州鱸Caspase-3的免疫學功能提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

健康加州鱸采集于中山某養殖場，規格（200±10）g/尾。本試驗所用常規試劑均購買于深圳市科普生物有限公司；RNA提取、cDNA反轉試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒和熒光定量相關試劑盒均由北京全式金生物技術有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成" 撈取暫養的健康加州鱸3尾，收集心臟、脾臟、頭腎、胸腺、腸道和肝臟等10個器官的組織各10～20 mg，迅速放入裝有Trizol（無RNA酶）的試管中，用DEPC水處理過的鋼珠打碎組織，然后置于-80 ℃保存。待樣品處理完畢后，取出冷凍保存的組織樣品，參照TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說明書提取加州鱸總RNA，再參照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。

1.2.2 Caspase-3基因全長的克隆" 根據NCBI上已知加州鱸基因組信息，設計克隆Caspase-3基因ORF序列的引物Caspase-3-F和Caspase-3-R（表1），PCR產物由廣州生工生物科技有限公司測序。

1.2.3 Caspase-3基因的生物信息學分析" 用生物信息學軟件對獲得的加州鱸Caspase-3序列進行拼接，并進行序列比對。然后利用生物信息學網站在線分析加州鱸Caspase-3的氨基酸理化性質、涉及的通路、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位以及三維結構。在NCBI上下載與加州鱸Caspase-3氨基酸相似的其他物種的Caspase-3序列，利用生物信息學分析軟件對這些氨基酸序列進行系統進化分析。

1.2.4 Caspase-3基因的組織表達分析" 根據Caspase-3基因序列，利用Primer 5.0軟件設計熒光定量引物qMs-Caspase-3-F和qMs-Caspase-3-R（表1），使用qTower 3.0熒光定量儀進行qRT-PCR反應，分析Caspase-3基因在健康加州鱸各組織中的特異性分布，qRT-PCR反應條件：90 ℃，3 min；95 ℃，10 s；60 ℃，5 s；共40個循環。qRT-PCR以β-actin基因為內參基因（表1），每個樣品重復檢測3次，試驗結果采用2-ΔΔCt法計算，用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析及圖表處理。

2 結果與分析

2.1 加州鱸Caspase-3基因的克隆

以Caspase-3-F、Caspase-3-R作為引物，以加州鱸頭腎組織中提取的RNA經反轉錄獲得cDNA，以cDNA作為模板進行PCR擴增，獲得的產物經測序后進行拼接，通過NCBI Blast分析鑒定該擴增產物為加州鱸Caspase-3基因。該基因的ORF為852 bp，可編碼283個氨基酸（圖1）。

2.2 加州鱸Caspase-3基因的生物信息學分析

根據生物信息學在線分析結果，Caspase-3蛋白的理論分子量為73.06 ku，理論等電點（PI）為5.09；脂溶指數為27.98；不穩定指數為40.23，總體平均親水性為0.790。經過蛋白親疏水性分析后發現該蛋白為親水性蛋白（圖2）。經信號肽在線預測分析，發現該蛋白前21個氨基酸為信號肽序列（圖3）。利用TMHMM Server 2.0預測跨膜結構域，發現不存在跨膜結構域。

蛋白質亞細胞定位預測Caspase-3蛋白在細胞中各位置的分布概率：33.3%（細胞壁）、33.3%（細胞質）、22.2%（細胞液）、11.1%（細胞核）。通過Cell-PLoc預測，Caspase-3蛋白定位于細胞質。通過SoftBerry-Psite預測該序列功能位點，發現該序列酪蛋白激酶II磷酸化位點6個，C末端定位信號序列微體5個，N-豆蔻酰化位點和CAAX box 各3個，蛋白激酶C磷酸化位點和細胞吸附序列各2個，N-糖基化位點、Caspase家族組氨酸活性位點和Caspase家族半胱氨酸活性位點各1個。

通過SOPMA預測加州鱸Caspase-3蛋白的二級結構，發現無規則卷曲由140個氨基酸組成，占49.47%；α-螺旋由80個氨基酸組成，占28.27%；β-轉角結構由18個氨基酸組成，占6.36%；延伸鏈由45個氨基酸組成，占15.90%（圖4）。利用SWISS-MODLE在線構建蛋白質三級結構，結果如圖5所示。

2.3 同源性及系統進化

不同脊椎動物Caspase-3的氨基酸多重序列比對結果如圖6所示，加州鱸Caspase-3與其他物種的相似度為45.85%～88.38%，與紅笛鯛（Lutjanus peru）的相似度最高，為88.38%。其中存在高度保守序列HIS信號（HSCHASFVCVLLSHG）和CYS活性位點（KPKLFFIQACRG）。將NCBI上已知的其他物種的Caspase-3基因和加州鱸Caspase-3基因通過N-J法構建系統進化樹，發現加州鱸與紅笛鯛聚為一支，這與多序列比對結果相符（圖7）。

通過實時熒光定量技術檢測Caspase-3基因在加州鱸組織中的相對表達量，試驗結果顯示，該基因在各個組織中均能表達，其中在腦組織中相對表達量最高，其次為肌肉和肝臟，在頭腎、鰓和眼等其他組織中相對表達量較低（圖8）。

3 結論與討論

本研究克隆了加州鱸Caspase-3基因ORF序列，全長852 bp，編碼283個氨基酸。該蛋白包含一個信號肽序列，剪切位點位于第20—21個氨基酸，屬于分泌性蛋白；其不穩定指數超過40，屬于不穩定蛋白；Caspase-3蛋白氨基酸序列親水性殘基較疏水性殘基多，表現為親水性，進一步說明Caspase-3屬于不穩定蛋白；Caspase-3蛋白二級結構主要由無規則卷曲和α-螺旋組成，與蛋白三級結構預測結果一致；亞細胞定位預測顯示Caspase-3蛋白主要位于細胞質，蛋白跨膜結構域分析結果顯示Caspase-3不存在跨膜結構域，這進一步證實了亞細胞定位結果，表明Caspase-3蛋白可能在細胞質中合成。對加州鱸Caspase-3蛋白進行生物信息學分析有利于揭示其可能參與的生物過程，為后續研究Caspase-3在加州鱸中的其他功能奠定了基礎。

將加州鱸Caspase-3氨基酸序列上傳至NCBI進行BLAST比對，結果顯示加州鱸Caspase-3基因與硬骨魚類序列非常相似，加州鱸與紅笛鯛的相似度最高，為88.38%。與斑馬魚、牛、雞和林蛙的相似度分別為74.19%、62.34%、62.01%和45.85%。盡管不同物種多序列比對的同源性有高有低，但其結構上都具有高度保守序列，如HIS活性位點和CYS活性位點。NJ系統進化樹表明，加州鱸與紅笛鯛聚為一支，表明它們可能來源于一個祖先，且與BLAST比對結果相符。綜合以上結果，表明加州鱸Caspase-3與其他物種的Caspase-3蛋白在結構上具有一定相似性，由結構延伸至功能，它們在功能上也可能具有相似性。

Caspase-3是細胞凋亡的關鍵介質，相應的Caspase蛋白酶通過內源性途徑和外源性途徑激活Caspase-3 [15]。近年來，Caspase-3已經在多種魚類物種中被克隆和鑒定，包括斑馬魚（Danio rerio）[16]、大黃魚（Larimichthys crocea）[17]、攀鱸魚（Anabas testudineus）[18]、河豚（Fugu obscurus）[19]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[20]、海鱸（Lateolabrax japonicus）[21]和牙鲆（Paralichthys olivaceus）[22]，此外有學者從舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）[23]中克隆了Caspase-3基因序列。加州鱸Caspase-3組織定量分布結果表明，該基因廣泛分布于各檢測組織中，這與以往的研究結果相符。其中Caspase-3在加州鱸腦中表達量最高，肌肉和肝臟的表達量次之，其他組織中的表達量較低，鰓的表達量最低。而在舌齒鱸[23]相關研究中，Caspase-3在脾臟、頭腎、肝臟和腸道中的表達量極低，而在胸腺和心臟中的表達量較高，與本試驗結果存在差異，這可能是Caspase-3在健康加州鱸中處于未激活狀態，也可能是不同物種間的特異性導致的差異。目前，Caspase-3在魚類中研究較少，且多集中于其在魚類發育和凋亡過程中的作用，如Yabu等[24]研究表明Caspase-3在誘導神經酰胺的產生以及在斑馬魚胚胎階段起著至關重要的作用。研究表明Caspase-3在不同魚類各組織中的表達量存在差異，后續試驗還需探究Caspase-3在加州鱸病毒感染中的作用并加以驗證。

本研究成功克隆了加州鱸Caspase-3基因，該基因cDNA全長890 bp，ORF為852 bp，可編碼283個氨基酸。通過生物信息學分析發現該基因具有一個典型的信號肽序列，剪切位點位于第20—21號氨基酸之間，不存在跨膜結構域，存在Caspase家族組氨酸活性位點和Caspase家族半胱氨酸活性位點各1個。熒光定量分析發現Caspase-3基因在健康加州鱸組織中均有表達，在腦、肌肉、肝臟中表達水平較高，在鰓組織中的表達量最低。

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（責編：何 艷）