奶牛PSME3基因CDS區克隆、表達及生物信息學分析

任倩倩，李宇航，楊 箭，羅仍卓么，王興平，魏大為，馬 云

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021；2.寧夏回族自治區反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021)

奶牛(Bostaurus)乳腺炎是奶牛養殖中最常見的炎癥性疾病，通常由乳腺組織受到創傷或感染金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等病原微生物引起[1]，影響奶牛的健康、產奶量與乳品質，給奶牛場造成極大的經濟損失，甚至威脅到人的飲食健康。近年來，關于奶牛乳腺炎預防與治療在分子水平上的研究，取得了有效進展。蛋白酶體廣泛存在于真核細胞的細胞質和細胞核中，可調節細胞生長周期和凋亡、調控基因轉錄以及DNA損傷修復等[2]，具有十分重要的生物學功能。

蛋白酶體激活亞基3(proteasome activator subunit 3，PSME3)又稱Ki抗原、PA28γ和REGγ，是蛋白激活11s家族的成員，可結合并激活20s蛋白酶體[3]。PSME3通過泛素化和ATP非依賴性方式促進多種蛋白的降解，參與NF-κB[4]、TGF-β[5]和Wnt[6]等信號通路，通過調節p21、p16和c-Myc等因子而調控能量代謝、先天免疫、血管生成和細菌感染等多種生理學過程[7-9]，在口腔癌[10]、乳腺癌[11]、胰腺癌[12]、結腸癌[13]、肝癌[14]和甲狀腺癌[15]等癌癥組織中均高表達。此外，PSME3可負調控p53，參與調節細胞周期，抑制腫瘤發生并促進細胞凋亡[16]。近年來研究表明，PSME3作為Hippo信號通路的關鍵因子，在人類炎癥中也發揮重要的調控作用[17]，然而，PSME3在奶牛乳腺炎中的作用研究還未見報道。因此，本試驗檢測PSME3基因在E.coli型乳腺炎奶牛乳腺組織中的表達情況，并進行PSME3基因CDS區的克隆、測序及功能預測分析，以期為進一步闡明PSME3在奶牛乳腺炎中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于基因克隆的奶牛乳腺組織樣采集于寧夏本地屠宰場。選取36月齡，處于泌乳盛期的荷斯坦奶牛，屠宰后收集乳腺組織，剪成小塊分裝到凍存管中，放入液氮帶回，于-80 ℃保存；用于表達分析的組織樣品來自于實驗室前期保存的經E.coli誘導乳腺炎的奶牛乳腺組織[18]。

1.2 試驗試劑

Trizol試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒和pMD19 T-Vector購自寶日醫生物技術(北京)有限公司，2×TaqMaster Mix(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技有限公司，DH5α感受態細胞購自北京索萊寶科技有限公司，柱式凝膠純化回收試劑盒購自Omega(美國)公司，2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(with Tli RNaseH)熒光定量試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取與cDNA合成 分別將健康奶牛和E.coli誘導乳腺炎奶牛的乳腺組織塊在液氮中迅速研磨，按照Trizol試劑說明書提取組織總RNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，BioTek多功能酶標儀(SYNERGY LX)測定濃度與純度。按照逆轉錄試劑盒說明書，去除總RNA中的基因組污染后，將總RNA逆轉錄為cDNA，-20 ℃保存，備用。

1.3.2 引物設計與合成 根據牛PSME3基因的序列(GenBank ID：XM_002696000)，利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR擴增引物和qPCR引物(表1)，由安徽通用生物有限公司合成，無菌無酶超純水溶解。

表1 引物信息

1.3.3 奶牛PSME3基因的qPCR分析 cDNA濃度稀釋為100 ng/μL，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因為內參基因，采用qPCR技術檢測PSME3基因在健康奶牛和E.coli誘導乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達。反應體系為20.0 μL，包含：2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq10.0 μL，cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共39個循環。基因的相對表達量用2-△△Ct法進行計算，數值用“平均 值±標準誤”表示。利用SPSS 22.0和GraphPad 8.3的單因素方差分析進行組間基因表達水平的差異顯著性分析，其中，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

1.3.4 奶牛PSME3基因CDS區克隆與測序 以奶牛乳腺組織DNA為模板擴增PSME3基因的編碼區，PCR反應體系為20.0 μL，包含：2×TaqMaster Mix 10.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34個循環，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物；采用凝膠純化試劑盒對產物進行純化回收。將回收產物與pMD19-T Vector在 16 ℃連接1 h，并將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，挑選陽性菌落，進行菌液PCR驗證后，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.3.5 奶牛PSME3基因CDS區的生物信息學分析 開放閱讀框架:利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析PSME3基因的開放閱讀框，并根據常用密碼子推導該基因所編碼的蛋白質序列。

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蛋白結構特征:利用PortParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)進行PSME3蛋白的理化性質分析；利用ProtScale在線工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析PSME3蛋白的親水性/疏水性；利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)進行磷酸化位點預測；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜區預測；利用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽序列預測；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)進行二級結構和三級結構預測。

蛋白功能：利用MEGA 4.0軟件進行同源性比對與系統發育樹構建；利用NCBI中CD Search在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行結構域預測；利用PSORT Ⅱ Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位；利用String在線工具(https://string-db.org/)進行蛋白互作 分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成

組織RNA提取完成后，測定濃度，OD260/OD280值為1.8～2.0，表明RNA的純度較高。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果顯示條帶完整，未見明顯降解(圖1)，可用于后續試驗。

A.健康奶牛的乳腺組織；B.E.coli誘導乳腺炎奶牛的乳腺組織

2.2 奶牛 PSME3 基因在奶牛乳腺組織中的 表達

以GAPDH為內參，利用qPCR技術檢測奶牛PSME3基因在健康和E.coli誘導乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達量。結果表明，與健康奶牛相比，PSME3基因在E.coli誘導的乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達量顯著上調(P<0.01)(圖2)。

A.健康奶牛的乳腺組織；B.E.coli誘導乳腺炎奶牛的乳腺組織；**代表差異極顯著(P<0.01)

2.3 奶牛 PSME3 基因CDS區克隆

以RNA逆轉錄的cDNA為模板，擴增PSME3基因的CDS區，用1%凝膠電泳進行檢測，結果顯示條帶單一，與目標片段大小一致。測序結果顯示均為單峰，片段大小為765 bp(圖3)。

圖3 奶牛 PSME3 基因CDS區PCR產物的電泳結果

2.4 奶牛 PSME3 基因CDS區生物信息學分析

利用OFR Finder分析奶牛PSME3基因mRNA的開放閱讀框。結果表明，PSME3基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，CDS區全長為765 bp，編碼254個氨基酸(圖4)，分子質量為29.506 ku。

矩形框內為引物序列

2.5 奶牛PSME3蛋白結構特征分析

2.5.1 分子組成 由PortParam在線工具對上述PSME3蛋白質進行分析。結果表明，組成奶牛PSME3蛋白質的氨基酸共有20種，其中以亮氨酸(Leu)占比最大，為11.8%，色氨酸(Trp)占比最少，為0.4%(圖5)。氨基酸殘基中，帶負電荷的殘基總數(Asp+Glu)為41個，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)有 36個。

圖5 奶牛PSME3蛋白的氨基酸組成

2.5.2 親水性/疏水性 奶牛PSME3蛋白的理化性質表明，該蛋白的理論等電點為5.69，總原子數有4 210個，原子結構為C1318H2136N352O396S8，不穩定指數為47.09，脂溶指數為104.33，平均親水性為-0.371，為親水性蛋白質(圖6)。

圖6 奶牛PSME3蛋白的親水性/疏水性分析

2.5.3 磷酸化位點預測 用NetPhos 3.1在線工具對PSME3蛋白的磷酸化位點進行預測。結果表明，奶牛PSME3蛋白存在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)3種氨基酸的19個磷酸化位點(閾值>0.5)，其中，Ser位點8個，分別位于第17、24、156、174、191、222、247和248位；Thr位點9個，分別位于第23、56、73、83、135、161、167、205和207位；Tyr位點2個，分別位于第84和214位(圖7)，這些磷酸化位點可能與蛋白質的活性有關。

圖7 奶牛PSME3蛋白的磷酸化位點預測

圖8 奶牛PSME3蛋白的二級結構預測

圖9 奶牛PSME3蛋白的三級結構預測

圖10 奶牛PSME3蛋白的跨膜區預測

2.6 奶牛PSME3蛋白功能分析

2.6.1 結構域 利用NCBI中Conserved Domains(CD Search)分析PSME3蛋白的保守結構域。結果發現，該蛋白包含PA28α和PA28β超家族結構域(圖11)，表明該蛋白與典型的蛋白酶體家族成員PA28α和PA28β同源，可能通過上述結構域發揮激活蛋白酶體的作用。

圖11 奶牛PSME3蛋白保守結構域預測

2.6.2 亞細胞定位與蛋白互作 通過Protein Subcellular Localization Prediction Tool在線工具對PSME3基因的CDS區編碼的蛋白進行亞細胞定位，結果顯示，該蛋白47.8%可能存在于細胞質中，34.8%存在于細胞核中，13%存在于線粒體中，4.3%可能在高爾基體中，表明該蛋白可能主要在細胞核和細胞質中發揮作用。此外，利用String在線工具分析蛋白質的互作網絡(圖12)，結果表明，PSME3蛋白可能與PSMA3、PSMA4、PSMA5、PSMB2、PSME2、FAM192A、NR1H3、IFNG、HSPA14和NOL7蛋白有相互作用。根據上述蛋白質的功能，推測奶牛PSME3可能調節細胞周期、增殖凋亡、血管生成、炎癥反應與抗原呈遞等過程。

圖12 奶牛PSME3蛋白的互作分析

2.6.3 同源性 利用DNAMAN軟件分析奶牛PSME3蛋白與小鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)、牦牛(Bosmutus)、綿羊(Ovisaries)、大鼠(Rattusnorvegicus)和黑猩猩(Pantorglodytes)等6個物種PSME3蛋白質的同源性，發現奶牛PSME3蛋白質與上述6個物種PSME3蛋白質序列同源性高達95.15%，表明各物種間PSME3蛋白質保守性較強，可能具有相似的生物學功能。并用MEGA 4.0軟件中鄰近法(Neighbor Joining，NJ法)構建系統進化樹(圖13)，奶牛與牦牛在系統進化樹中距離最近，聚為一類，與大鼠距離最遠。

圖13 不同物種PSME3蛋白的系統進化樹

3 討 論

奶牛乳腺炎的預防與治療一直以來是亟需解決的難題，乳腺組織在E.coli和S.aureus等病原菌入侵后，白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1 beta(interleukin-1 beta，IL-1β)和腫瘤壞死因子ɑ(tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ)等促炎細胞因子的表達量上升，發生炎癥反應[19]。PSME3作為蛋白酶體激活11s家族的成員，于1990年在患有系統性紅斑狼瘡患者的血清中被發現，其家族成員還有PA28α和PA28β[20]。PSME3以泛素化和ATP非依賴性降解下游靶蛋白的作用方式受到廣泛關注，在人乳腺癌[21]等疾病中的作用機制是近年來的研究熱點。因此，本研究采用qPCR法檢測PSME3基因在奶牛乳腺組織中的表達模式，并通過克隆獲得PSME3基因的CDS區序列，采用生物信息學方法預測PSME3蛋白的生物學功能，為進一步探討PSME3在奶牛乳腺炎中的調控作用提供參考。

本試驗采用qPCR法檢測PSME3基因在E.coli型奶牛乳腺炎乳腺組織中的表達量，與健康乳腺組織相比，PSME3基因在炎性組織中的表達量顯著上調；Sun等[22]研究表明，在E.coli或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)處理過的小鼠巨噬細胞中，PSME3基因的mRNA和蛋白水平的表達量均上調，與本研究結果一致。此外，他們還發現PSME3可參與調控Toll樣受體信號通路和NF-κB信號通路，與小鼠巨噬細胞炎癥調節有關[22]。Khan等[23]研究發現，與PSME3互作的PSMA3在蛋雞傳染性支氣管炎癥反應中表達顯著上調，調節NF-κB信號通路。因此，推測PSME3可能通過NF-κB信號通路調節奶牛乳腺組織炎性反應過程。

本研究通過PSME3基因所編碼蛋白質的成分分析，發現亮氨酸占比最大(11.8%)。有報道顯示，亮氨酸廣泛存在于各種病毒和真核生物中，參與多種蛋白質的合成，調控機體代謝、細胞周期和免疫反應等生理過程[24-25]，推測奶牛PSME3蛋白有可能與上述生物學過程相關，有待于深入研究。通過對PSME3基因編碼蛋白的理化性質分析，該蛋白為較穩定酸性親水性蛋白，且不具有信號肽序列，無跨膜結構域，是非分泌型蛋白，主要分布在細胞質和細胞核中，可能促進細胞核中蛋白質代謝的后期或在控制生物體內活性肽水平中發揮特殊作用[26]。此外，對PSME3蛋白的磷酸化位點的預測也表明其功能的復雜性。

對PSME3基因編碼蛋白的二級與三級結構分析發現，PSME3蛋白的二級結構由α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈和β-轉角組成，其三級結構形成同源低聚物，由于單體螺旋之間的相互作用，使其高級結構十分穩定，這就保證PSME3蛋白在細胞需要或特定的條件下更高效地與蛋白酶體結合并發揮作用[27]。另外，本研究結果表明PSME3蛋白包含PA28α和PA28β結構域；Masson等[28]研究發現，REGβ可能來源于REGα基因，并且REGα由γ亞基樣前體系統的基因復制產生；而Murray等[29]對果蠅來源的REGγ亞基的研究，證實其序列和功能與典型的REG蛋白家族的基因序列最為相似，調控細胞質膜生成、細胞增殖凋亡和炎性損傷等過程。

同源性和系統進化分析結果表明，PSME3蛋白在奶牛和其他物種間比較保守，說明PSME3蛋白在進化過程中具有很強的穩定性，也反映出該蛋白在多物種中發揮著穩定的生物學功能。蛋白互作分析結果表明，PSME3蛋白與PSMA3、PSMA4、NR1H3、HSPA14、PSMA5、PSMB2、PSME1、PSME2、IFNG和NOL7蛋白有互作關系。PSME3與PA28激活劑家族的其他蛋白如PSMA3和PSMA4具有較強的相互作用，此外，PSMA4[30]和NR1H3[31]調控人角質細胞和肝細胞的細胞周期和增殖，同時NR1H3[32]是糖尿病腎臟疾病的標志蛋白；HSPA14[33]在人肝細胞癌癥中高表達；PSMA5在奶山羊和奶牛乳腺組織中與共軛亞油酸的生物合成有關[34]；PSMB2[35]和PSME1[36]被發現在免疫反應中發揮抗原呈遞的作用；IFGN[37]可增強人和各種動物的免疫功能；NOL7[38]在宮頸癌中是一種新型的腫瘤抑制因子，通過下調促血管生成因子和上調抗血管生成因子，在血管生成中起主要調控作用。結合PSME3蛋白在不同物種間具有很強的保守性，推測PSME3可能與上述蛋白相互作用調控細胞周期、增殖凋亡、血管生成以及免疫反應等生物學 過程。

4 結 論

奶牛PSME3基因在E.coli誘導乳腺炎的奶牛乳腺組織中的表達顯著高于健康乳腺組織。奶牛PSME3基因的編碼區全長為765 bp，編碼由254個氨基酸組成的非分泌型蛋白質，含有PA28α和PA28β結構域，與PSMA3、PSMA4、NR1H3、HSPA14、PSMA5、PSMB2、PSME1、PSME2、IFNG和NOL7蛋白等相互作用，可能通過NF-κB信號通路參與乳腺細胞的質膜合成、細胞周期、增殖凋亡以及乳腺組織的免疫反應等多種生物學過程。該結果可為深入研究PSME3在奶牛乳腺炎中的功能和奶牛抗乳腺炎分子育種提供參考。