山羊肺源腸外致病型大腸桿菌的分離鑒定、耐藥性測定和毒力基因檢測

徐海軍,李小紅,爨淑楠，張婭菲，賈 哲，王書明，張圣堯

(1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽六安 237012；2.安徽金豐源畜牧科技有限公司，安徽六安 237000)

大腸桿菌可分為共生型、腸內致病型和腸外致病型(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli, ExPEC)3類菌群。共生型大腸桿菌是正常腸道菌群的重要組成部分，但致病型大腸桿菌可引起人和動物的疾病。腸內致病型大腸桿菌包括腸致病性大腸桿菌、產腸毒素大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌、彌散黏附性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌，可引起腹瀉、仔豬水腫病、畜禽敗血癥、人溶血尿毒綜合癥[1]。ExPEC不引起宿主腸道感染，但可以侵襲、定植于腸外組織，導致泌尿系統感染、新生兒腦膜炎、肺炎、心內膜炎、敗血癥等[2-4]。動物源的ExPEC也可以通過污染的食品傳染給人，對人類健康構成威脅[5-6]。

隨著養羊業的規?；⒓s化發展，由腸內致病型大腸桿菌引起的山羊大腸桿菌病已成為一種常見病和多發病，主要表現為羔羊腹瀉。近年來，羊感染ExPEC的報道也日漸增多[7-8]。由于ExPEC感染引起的癥狀和病變缺乏特異性，給基層準確診斷本病造成了一定困難。

2020年11月，安徽金豐源畜牧科技有限公司動物疾病診斷實驗室從發病山羊肺臟分離得到1株細菌，通過分離純化、16S rRNA基因序列分析，結合菌體形態特征和選擇性培養基上菌落形態特征，鑒定為大腸桿菌。對該菌開展溶血試驗、系統進化群分析、致病性測定、進化樹構建、毒力基因檢測、耐藥性檢測，并選擇敏感藥物對患病山羊進行治療。期望研究結果能為進一步研究該菌的生物學特性和致病機理奠定基礎，同時也為山羊ExPEC性肺炎的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑藥品 胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic soybean peptone agar, TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯、伊紅美藍瓊脂、麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司；無菌脫纖綿羊血購自南京亞松生物科技有限公司；Taq酶、dNTP Mix、DNA Marker等購自TaKaRa公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；革蘭氏染色液、藥敏紙片(呋喃唑酮、復方新諾明、萬古霉素)購自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片(卡那霉素、新霉素、頭孢曲松、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星、阿莫西林、氟苯尼考、紅霉素)購自常德比克曼生物科技有限公司；頭孢噻呋鈉粉針劑購自內蒙古聯邦動保藥品有限公司；麻杏石甘散購自上海億源生物藥業有限公司。

1.1.2 主要儀器 AE124型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；HGPN-II-270型隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)；GI54DP型立式自動壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器有限公司)；DHG-9035A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；XS-208B型生物顯微鏡(濟南德勝光電儀器有限公司)；HC-2518R型冷凍高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；DYCP-31DN型DNA 電泳槽、DYY-5型穩壓電泳儀(北京六一儀器廠)；2720型PCR儀(Applied Biosystems)；FR980型凝膠成像儀(上海復日科技儀器有限公司)。

1.1.3 試驗動物 昆明種雄性SPF級小鼠10只，體質量(20±2)g，購自安徽中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病史調查、臨床癥狀與病理剖檢觀察 2020年11月下旬，六安市金安區某山羊養殖戶飼養的2月齡小山羊陸續出現零星發病，癥狀為精神不振，氣喘，發病較突然，有的在外面放牧時發病，體溫38～40.5 ℃。發病半個月以來累計死亡6只小山羊，大山羊和母山羊未發病。2020年12月1日，又有1只小山羊發病，送來就診。該羊較瘦，極度虛弱，精神高度沉郁，耳根發涼，但氣喘不明顯，也未見咳嗽。該羊送達后不久死亡，對其進行了病理剖檢觀察。

1.2.2 細菌分離純化、革蘭氏染色鏡檢及溶血試驗 無菌操作采集病死羊病變肺組織，涂擦接種于TSA平板，37 ℃培養18 h。用接種環挑取長出的菌落用劃線接種法分別轉接于TSA平板、伊紅美蘭平板和麥康凱平板，37 ℃培養18 h后，觀察菌落形態，挑取TSA平板上的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，并挑取單個菌落進行純化培養。將純化的分離菌接種于含5%無菌脫纖綿羊血的TSA平板，37 ℃培養18 h后，觀察有無溶血。

1.2.3 分離菌16S rRNA基因測序、進化樹構建 將分離菌純化培養3次的TSA平板純培養物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rRNA基因測序。將獲得的基因序列在NCBI網站利用BLAST程序進行相似性比對，根據比對結果，結合分離菌在選擇性培養基上的菌落特征確定分離菌株的生物種屬。選取相似性高的序列，運用 MEGA 7.0軟件采用鄰接法構建該菌的系統發育進化樹。

1.2.4 系統進化群鑒定 參照文獻[9]合成擴增系統進化群分群基因(chuA、yjaA和TspE4.C2.)的特異性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列、退火溫度及擴增片段預期大小見表1。用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離菌基因組DNA，并作為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(不同引物的退火溫度見表1)，72 ℃ 90 s，循環30次；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR 反應產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統觀察并記錄結果。切下凝膠中的目的條帶，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收擴增產物進行測序，并與GenBank中的參考序列進行相似性比對。

表1 研究中使用的引物序列

1.2.5 致病性試驗 將10只小鼠隨機分為攻毒組和對照組，每組5只。將分離菌菌種接種于胰大豆蛋白胨肉湯中，37 ℃培養18 h，4 ℃、5 000 r/min離心 5 min 收集菌體，用滅菌生理鹽水懸浮菌體，進行細菌計數。根據計數結果將細菌濃度調整至108CFU/mL，攻毒組小鼠按每只0.5 mL劑量腹腔注射菌液，對照組小鼠腹腔注射等體積滅菌生理鹽水，注射后連續7 d觀察記錄小鼠狀態和死亡情況。對死亡小鼠進行剖檢，觀察病變情況并從肝臟中分離細菌。

1.2.6 毒力基因檢測 根據文獻[8-11]設計并合成擴增ExPEC毒力基因papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT、irp2、irp1、tsh、ler、iss、papC、kpsMTII、focD、iroN、ompA、ompT、fimH、hylA、gafD、cnf1、bmaE、cvaC、ibeA、iucD、traT、iha、nfaE和malX的引物，序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以細菌基因組為模板對32種毒力基因進行PCR擴增。對擴增產物進行測序，并與GenBank中的參考序列進行相似性比對。

1.2.7 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2017推薦的標準K-B紙片法進行藥敏試驗，先將分離菌用涂布棒均勻涂布接種在TSA平板上，再將9類13種藥敏紙片均勻貼于培養基表面，37 ℃培養18 h后，測量抑菌圈直徑，判定藥敏試驗結果。以E.coliATCC 25922作為質控菌株。

1.2.8 防治措施 依據藥敏試驗結果，選用敏感抗菌藥對患病山羊進行治療，對全群山羊進行給藥預防。加強飼養環境消毒，保持良好衛生條件。

2 結果與分析

2.1 病理剖檢

該病羊剖檢病變為一側肺臟上半部分散在不規則形紅色肝變病灶(圖1)、心肌較軟，其余未見明顯異常。

圖1 患病山羊一側肺臟上半部散在不規則形紅色肝變病灶

2.2 細菌分離純化、革蘭氏染色鏡檢及溶血試驗

從患病山羊病變肺臟組織分離到40個灰白色菌落，經純化培養后，分離菌在TSA平板上的菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、灰白色、隆起(圖2)；在伊紅美藍平板上的菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑、深紫黑色、帶有金屬光澤(圖3)；在麥康凱平板上的菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、紅色(圖4)。挑取TSA平板上單菌落制成細菌涂片，革蘭氏染色鏡檢結果表明該菌為短桿狀的革蘭氏陰性菌(圖5)。溶血試驗表明該菌無溶血現象(圖6)。

圖2 分離菌在TSA平板上的菌落形態

圖3 分離菌在伊紅美蘭平板上的菌落形態

圖4 分離菌在麥康凱平板上的菌落形態

圖5 分離菌的革蘭氏染色鏡檢結果(1 000×)

圖6 分離菌的溶血試驗結果

2.3 分離菌16S rRNA基因鑒定結果及進化樹的構建

將測序獲得的分離菌16S rRNA基因(1 481 bp)序列在NCBI上利用BLASTn檢索程序進行序列相似性比對，結果顯示分離菌的16S rRNA基因序列與E.colistrain RHB08-C16(CP057959.1)、E.colistrain RHB18-C23(CP057660.1)、E.colistrain RHB08-C20(CP055971.1)、E.colistrain RIVM C018249(CP068802.1)、E.colistrain EC931(CP049118.1)的16S rRNA基因序列相似度均為99.66%。值得注意的是，分離菌的16S rRNA基因序列與Salmonellasp.S13(CP047094.1)和Shigellaboydiistrain FBD007(EU009178.1)的相似度達到99.73%。但綜合分離菌的形態特征、選擇性培養基上菌落形態特點和16S rRNA 基因序列的比對結果，將該分離菌最終鑒定為埃希氏菌屬的大腸桿菌，將其命名為E.coli-LA-goat。

選取與分離菌相似性高的大腸桿菌16S rDNA序列，運用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構建系統發育進化樹，結果顯示分離菌株的16S rRNA 基因序列與大腸桿菌E.coliRH808-C16(CP057959.1)株、E.coliRHB18-C23(CP057660.1)株的相應序列聚為一支，置信度為100%(圖7)，說明三者在進化上親緣關系非常近。

圖7 分離菌基于16S rRNA基因序列的發育進化樹

2.4 系統進化群鑒定結果

系統進化群分群基因(chuA、yjaA和TspE4.C2.)檢測結果(圖8)顯示該菌TspE4.C2.呈陽性，chuA和yjaA基因PCR擴增結果為陰性。因此，參照大腸桿菌系統進化性組別檢索表[12](表2)，確定該菌屬于B1群。

表2 大腸桿菌系統進化性組別檢索表

1～4分別為chuA、yjaA、 TspE4.C2.基因和陰性對照(蒸餾水)擴增產物電泳圖。 TspE4.C2.基因擴增結果呈陽性，大小為150 bp

2.5 分離菌致病性試驗結果

試驗組小鼠注射完菌液后24 h內，均出現萎靡不振、雙目緊閉、被毛粗亂、食欲下降或廢絕，并伴有嚴重的腹瀉，瀕死小鼠表現為全身顫抖、呈腹式呼吸。試驗組攻毒后第2天小鼠死亡3只，第3天1只小鼠發生嚴重腹瀉，1只小鼠精神好轉、被毛恢復光澤，第4天無小鼠死亡，第5天腹瀉小鼠死亡，第6天后無死亡小鼠。對照組無小鼠死亡。因此，該分離菌對小鼠的致死率為80%(4/5)(表3)。

表3 分離菌對小鼠致病性測定結果

剖檢攻毒死亡小鼠發現肝臟、脾臟腫大，呈黑紅色，肺臟有白斑樣病灶，胃、腸道內有黃褐色積液，并伴有惡臭味。無菌采集小鼠肝臟組織涂擦接種到麥康凱平板、TSA平板均分離到與攻毒菌菌落形態一致的細菌菌落；將TSA平板上的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，結果呈革蘭氏陰性，且形態特征與大腸桿菌一致。說明山羊肺臟分離菌能夠致死小鼠，具有很強的致病性。

2.6 分離菌毒力基因檢測結果

對ExPEC的32種毒力基因進行PCR檢測，結果顯示該菌株攜帶的毒力基因有iutA(314 bp)、afa(594 bp)、tsh(581 bp)、ompA(718 bp)、fimH(484 bp)、gafD(855 bp)、iucD(710 bp)、traT(283 bp)，未檢測到其他毒力基因(圖9)。毒力基因的PCR產物測序結果與GenBank參考序列的相似性大于99%。

1～35分別為各毒力基因擴增產物電泳圖，其中18、27和35為蒸餾水陰性對照。毒力基因iutA(4)、afa(6)、tsh(12)、ompA(20)、fimH(22)、gafD(24)、iucD(30)、traT(31)擴增結果呈陽性；其他毒力基因擴增結果呈陰性

2.7 分離菌藥敏試驗結果

分離菌藥敏試驗結果見圖10和表4，可見分離菌對頭孢曲松、氟苯尼考、恩諾沙星和阿米卡星中度敏感，對卡那霉素、新霉素、阿莫西林、慶大霉素、多粘菌素B、呋喃唑酮、復方新諾明、萬古霉素、紅霉素等9種抗菌藥耐藥。

表4 分離菌耐藥性試驗結果

1.新霉素；2.阿米卡星；3.阿莫西林；4.慶大霉素；5.頭孢曲松；6.紅霉素；7.氟苯尼考；8.恩諾沙星；9.萬古霉素；10.呋喃唑酮；11.多粘菌素B；12.復方新諾明；13.卡那霉素

2.8 防治措施及效果

就診當天，讓養殖戶回去后將患病山羊隔離，用牛羊鹿流感咳喘注射液(成分為林可霉素和鏈霉素)肌注治療，次日根據藥敏試驗結果改用頭孢噻呋鈉肌注治療，按體質量每公斤10 mg，1次/d，連續5 d。對其余未發病山羊用頭孢噻呋鈉肌注預防，1次/d，連續2 d；同時全群山羊用麻杏石甘散(成分為麻黃30 g、苦杏仁30 g、石膏150 g、甘草30 g)拌料，每只羊30～60 g，連喂5 d。每天清掃、消毒1次羊圈和運動場，連續消毒5 d。2021年12月10日下午回訪得知羊群未再發病，病羊已治愈。

3 討 論

目前，羊的呼吸系統疾病已成為嚴重危害養羊業健康發展的一類疾病，其病原組成復雜，可由細菌、病毒、真菌、支原體、寄生蟲等的一種或幾種引起[13]。本研究從病羊肺臟組織中分離的細菌經純化培養、選擇性培養基培養、革蘭氏染色鏡檢、16S rRNA基因序列比對、致病性測定和ExPEC標記基因檢測，可以確定該菌為腸外致病型大腸桿菌。藥敏試驗結果表明，該菌株有較嚴重的耐藥現象，耐藥譜較廣，只對頭孢曲松、恩諾沙星、阿米卡星和氟苯尼考表現中度敏感。建議臨床上在使用抗菌藥之前盡可能對病原菌進行藥敏試驗，然后選擇敏感藥物進行治療，以提高治療效果。

大腸桿菌是條件性致病菌，飼養管理措施不當(如環境條件差、轉群應激、斷奶應激、突然變換飼料、氣候突變等原因)容易誘發大腸桿菌病的發生。本次發病可能與冬季氣溫低、未做好保溫工作有關。

ExPEC感染難以通過病史調查、臨床癥狀觀察和病理剖檢進行確診。病原分離鑒定是確診ExPEC感染的可靠方法。但也要注意，不能單純依賴細菌16S rRNA基因測序來進行細菌鑒定，還要綜合考慮其他鑒定方法的鑒定結果，方能得出正確結論。例如，本病例中，分離菌的16S rRNA基因序列與沙門氏菌Salmonellasp.S13(CP047094.1)、志賀氏菌Shigellaboydiistrain FBD007(EU009178.1)的相似度為99.73%，高于與大腸桿菌的相似度(99.6%)，但綜合考慮在選擇性培養基上的菌落特點，將該分離菌最終鑒定為大腸桿菌。需要指出的是，如果遇到用16S rRNA基因測序和選擇性培養基培養等常規方法均無法有效鑒別時，還可以考慮用PCR法擴增相應菌的特異性基因進行鑒別。雖然本研究只進行了細菌分離，未進行支原體和病毒的檢測，但從采用頭孢噻呋鈉和麻杏石甘散治療就控制了本病的治療結果看，ExPEC可能是引起羊群本次發病的唯一病原。本病例中肺部病變區域與正常區域分界清晰，病變部位呈暗紅色肝變，面積較大，位于肺的上半部。這一病變特點與郭強強等[8]在綿羊上觀察到的ExPEC引起的肺炎病變十分相似，但后者在肝變區域還散在灰白色斑塊狀病灶。肺部的上述病變能否作為ExPEC性肺炎的特征病變還有待通過更多的病例觀察進行判斷。

本次疫情中，發病山羊病程較短，大多發病 2～3 d后即死亡，這也說明本次疫情中引起發病的ExPEC具有很強的致病力。ExPEC通過其特有的毒力因子侵襲、定植于腸外組織并引起感染。已發現ExPEC具有多種不同功能的毒力基因，例如黏附素相關基因(fimH、sfaS、tsh、papA、papC、afa、focD、focG、iha、bmaE、nfaE和gafD)、游離鐵攝取相關基因(iutA、iron、iucD和ireA)、莢膜多糖相關基因(kpsMTⅡ)、外膜蛋白相關基因(ompA、ompT、traT和iss)、毒力島相關基因(irp1、fyuA、irp2、ler和malX)、毒素相關基因(hylA、hlyD、vat、cnf1、cvaC和ibeA)[14-16]。本研究對ExPEC 32個毒力基因檢測結果表明該菌株攜帶毒力基因iutA、afa、tsh、ompA、fimH、gafD、iucD、traT。

鐵是所有生物體正常代謝和生長的基本元素，細菌需要10-7～10-5mol/L濃度的鐵才能正常生長和分裂；然而，宿主系統的游離鐵濃度非常低，例如人類血清中游離鐵濃度估計為10-24mol/L。ExPEC主要通過兩種方式獲得宿主的鐵元素：一種方式是產生溶血素使紅細胞破裂釋放出血紅蛋白，然后直接奪取血紅素中的鐵元素；另一種方式是產生鐵載體，通過鐵載體與宿主轉鐵蛋白和乳鐵蛋白競爭攝取鐵元素。本研究分離的ExPEC沒有溶血作用，這與周磊[1]分離到的54株豬源ExPEC沒有溶血作用一致。另外，Zhu 等[17]分離的豬源ExPEC大部分(92.3%)不溶血，只有一小部分(7.7%)產生β溶血；Costa 等[18]分離的豬源ExPEC同樣只有一小部分(4.9%)分離株產生β溶血，絕大部分(95.1%)的分離株不溶血；但王顯峰等[19]從有呼吸困難、流鼻涕癥狀的病羊鼻腔拭子中分離到的ExPEC有β溶血作用。這些結果說明雖然溶血作用可產生充足的鐵離子供ExPEC生長，但溶血作用并不是ExPEC致病作用所必需的。有溶血作用的ExPEC致病性也不一定強于沒有溶血作用的ExPEC。沒有溶血作用的ExPEC可以通過產生鐵載體從宿主獲得生長所需的鐵。大腸桿菌的鐵載體包括氣桿菌素和腸桿菌素兩種類型。不同于腸桿菌素，氣桿菌素能循環利用，因此其運載鐵的效率更高，這一特點有利于增強ExPEC的致病力，促進ExPEC的持續感染和在深部組織中的感染[20]。氣桿菌素由5個基因編碼，其中4個基因(iucA、iucB、iucC和iucD)參與氣桿菌素的合成，1個基因(iutA)編碼膜受體，它們均受一個操縱子控制[21]。本研究分離到的ExPEC攜帶有iutA基因和iucD基因，說明該菌能表達氣桿菌素作為鐵載體從宿主獲取鐵，從而佐證了該菌具有較強的致病力。

黏附是ExPEC感染的關鍵一步。ExPEC通過黏附素與組織上皮細胞結合，從而進入腸外組織，并引起腸外組織感染。黏附素可以是菌毛，也可以是非菌毛。菌毛黏附素包括Ⅰ型菌毛(FimH)、S 菌毛(Sfa)等；非菌毛黏附素包括溫度敏感血凝素(tsh)、非菌毛黏附物質(Afa)等[22-23]。afa基因編碼定植于上皮細胞(如尿道上皮和腸上皮細胞)的黏附蛋白，因此在引起尿道和腸道感染的致病性E.coli中廣泛存在。但在其他部位的ExPEC中afa基因表達并不普遍。例如，馬增軍等[24]從病豬肝、脾、肺、腎中分離到的8株ExPEC中均未檢出afa基因。郭強強等[25]從綿羊肺中分離的10株ExPEC中，僅有1株攜帶afa基因。本研究分離的ExPEC攜帶豐富的黏附相關基因，既包含I型菌毛基因(fimH)，也包含非菌毛黏附素基因(afa、tsh和gafD)。該菌攜帶如此多的黏附相關基因，可能與其定植在腸外組織發揮致病作用有密切關系。

該菌還表達外膜蛋白OmpA和TraT。OmpA普遍存在于革蘭氏陰性菌表面，發揮多種功能，如黏附、毒性、侵襲性和生物膜形成[26]。TraT是一種菌體外膜脂蛋白，與菌體的補體抗性和致病力關系密切[27]。該菌同時具有這兩種外膜蛋白，可能與其較強的致病力有一定關系。

本研究共檢測ExPEC 32種毒力基因，結果檢測到分離菌攜帶8種毒力基因(iutA、afa、tsh、ompA、fimH、gafD、iucD、traT)。Johnson等[28-29]認為ExPEC中5個毒力標記基因(PapA/Papc，sfa/foc，afa/dra，iutA和 kpsMTⅡ)中至少存在2個，即可認定為ExPEC。因此，根據這一標準，本研究中分離到的大腸桿菌可被認定為ExPEC。并且，該菌具有多種類型的毒力因子，致使其具有較強的致病性。

4 結 論

本研究從安徽金豐源畜牧科技有限公司動物疾病診斷實驗室接診的某山羊養殖場的病羊肺臟組織中分離并鑒定了1株ExPEC，該菌屬于B1群，沒有溶血作用，對小鼠的致死率為80%，攜帶8個毒力基因(iutA、afa、tsh、ompA、fimH、gafD、iucD、traT)。該菌對頭孢曲松、恩諾沙星、阿米卡星和氟苯尼考表現中度敏感，對其他9種抗菌藥耐藥。對發病山羊肌注頭孢噻呋鈉，同時使用麻杏石甘散拌料飼喂，用藥后病情得到有效控制。本研究結果可為臨床診斷和治療山羊ExPEC引起的肺炎提供參考。