4株促紫花苜蓿生長的芽孢桿菌分子鑒定及其生物活性分析

陳 蘭，謝永麗,2，吳曉暉，楊 雪，王 添，武玲玲

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；2.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

農(nóng)牧業(yè)是青海省重要的支柱產(chǎn)業(yè)，然而高海拔地區(qū)牧草生長期短，產(chǎn)草量低，加上鼠害、過度放牧等因素影響，加劇了高寒草地植被退化、畜牧業(yè)發(fā)展不平衡現(xiàn)象[1]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是多年生豆科植物，其莖葉中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，作為牧草飼料或直接用于青飼、干草都可為畜禽的生長發(fā)育提供營養(yǎng)，同時(shí)，利用人工種植紫花苜蓿可以提高退化植被恢復(fù)率、防止水土流失，改良鹽堿地等[2]。作為青海省的優(yōu)良栽培牧草，紫花苜蓿具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，然而青藏高原海拔高、氣溫低、干旱等極端生境造成紫花苜蓿的正常生長發(fā)育受到限制，導(dǎo)致植株死亡率大幅增加[3]。陳華等[4]從枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株JA中分離出抗生素，研究發(fā)現(xiàn)其可對灰霉病菌(Botrytiscinerea)產(chǎn)生拮抗作用，從而提高植物抗病性；黃秋斌等[5]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)菌株B3-7能夠定殖在小麥(Triticumaestivum)根系，降低小麥紋枯病(wheat sharp eyespot)的侵染，并可提高小麥生物量。因此，利用有益微生物與優(yōu)良牧草互作，對于提高牧草抗病性、促進(jìn)牧草生長，增強(qiáng)牧草對鹽堿、低溫、干旱等特殊生境的抗性，改善貧瘠土壤的理化性以及提高牧草養(yǎng)份的釋放效率均具有重要意義。

青藏高原特殊生境孕育著特殊適生性微生物資源。芽孢桿菌是一類廣泛存在于土壤中的植物根際促生菌，應(yīng)對不利條件會(huì)產(chǎn)生具有特殊抗性的內(nèi)生孢子，因此，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的價(jià)值和應(yīng)用極為重要[6]。芽孢桿菌屬分為多個(gè)亞群，其中絕大多數(shù)菌株都具有特殊生防功能[7]，能夠產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物脂肽化合物(lipopeptide)，對病原菌正常生長產(chǎn)生干擾或直接破壞其生存環(huán)境，抑制病原菌進(jìn)一步擴(kuò)展，從而間接促進(jìn)植物生長[8-9]，通過生物固氮的方式為土壤提供有機(jī)氮，不僅促進(jìn)土壤營養(yǎng)元素循環(huán)、改善土壤肥力，還可定殖在植物根系提供氮元素，促進(jìn)植物吸收利用[10]。王繼雯等[11]研究發(fā)現(xiàn)對小麥?zhǔn)┯霉痰挎邨U菌菌株C2菌劑會(huì)明顯促進(jìn)其主根的生長，同時(shí)可提高土壤養(yǎng)分含量。因此，利用具有良好生防功能的本土芽孢桿菌，對于防治植物病害、提高作物生物量及優(yōu)化貧瘠土壤具有重要意義。此外，芽孢桿菌可產(chǎn)生胞外纖維素酶等能夠有效降解植物木質(zhì)纖維素[12]，將此類生防芽孢桿菌應(yīng)用于飼草料加工、秸稈降解中，不僅能減輕青海高原秋冬季節(jié)家畜飼草料供應(yīng)不足的問題[13]，還能改良土壤肥力[14]。因此，篩選利用能降解纖維素的芽孢桿菌菌源，是提高秸稈還田效率、促進(jìn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施。本研究以分離自青海烏蘭荒漠沙地白刺(Nitrariatangutorum)根際的4株芽孢桿菌菌株為供試菌，以菌懸液(濃度為1×107cfu/mL)對紫花苜蓿灌根測定其對牧草促生效果，測定菌株拮抗4種病原真菌活性、固氮能力、降解纖維素活性及耐鹽、低溫適生性，對菌株進(jìn)行16S rDNA及gyrB分子鑒定，以期篩選出對高原特殊環(huán)境有強(qiáng)適應(yīng)性和適生性的拮抗芽孢桿菌，為促進(jìn)紫花苜蓿生長、退化植被恢復(fù)、飼草料加工等提供優(yōu)質(zhì)菌源。

1 材料與方法

1.1 材 料

芽孢桿菌：菌株WL81、WL911、WL92、WL99分離自青海烏蘭荒漠地白刺(N.tangutorum)根圍。

病原真菌：禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)分離自小麥(Triticumaestivum)、銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum)分離自梭羅草(Roegneriathoroldiana)、鏈格孢(Alternariaalternata)分離自老鸛草(Geraniumwilfordii)、黑曲霉(Aspergillusniger)分離自高山嵩草(Kobresiapygmaea)。

培養(yǎng)基及試劑：LB培養(yǎng)基[6]；低溫1C培養(yǎng)基[15]；PDA培養(yǎng)基[16]；改良阿須貝(Ashby)無氮固體培養(yǎng)基[17]；CMC-Na培養(yǎng)基[18]。

儀器：ZHWY-200D 恒溫振蕩培養(yǎng)箱；SIGMA 3K15 離心機(jī)；PRX-800A 智能人工氣候箱。

草種：紫花苜蓿(Medicagosativa)種子由青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 芽孢桿菌促紫花苜蓿生長測定 芽孢桿菌菌懸液制備：在37 ℃、180 r/min條件下，將菌株WL81、WL911、WL92和WL99在LB液體中活化14 h，倒入50 mL 離心管，10 ℃、6 000 r/min 離心5 min，棄上清，無菌水洗菌體3次，加入適量無菌水、渦旋1～2次制成懸浮液，以LB液體為對照，測定OD600的吸光度值，將濃度調(diào)成 1×107cfu/mL(OD600=1.0)[19]，備用。

芽孢桿菌促紫花苜蓿生長：用70%(體積比)的H2SO4溶液浸泡紫花苜蓿種子10 min，無菌水沖洗3次，加入100 mL 0.1%(體積比)的H2O2消毒5 min，用無菌水沖洗干凈；天然土與蛭石按質(zhì)量比(2∶1)比例混勻后滅菌；隨機(jī)選取20粒處理后的紫花苜蓿種子播入穴盆中，置于智能人工氣候箱中培養(yǎng)(26 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗)。待幼苗株高達(dá)到3～5 cm，用45 mL菌懸液對植株進(jìn)行灌根處理，對照組用同體積的無菌水處理；繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，取出紫花苜蓿幼苗，保持植株干凈完好，測量其株高、根長，吸干根表水分后測定鮮質(zhì)量[19]。

1.2.2 芽孢桿菌拮抗活性測定 打取直徑為 7 mm禾谷鐮孢(F.graminearum)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)、鏈格孢(A.alternata)、黑曲霉(As.niger)的菌餅，分別接種在新的PDA平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)2 d；以菌餅為中心的4個(gè)對稱點(diǎn)作為接種點(diǎn)，各放置一個(gè)直徑4 mm的濾紙小圓片。分別挑取菌株WL81、WL911、WL92和WL99的單菌落置于含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃，180 r/min活化14 h，吸取5 μL菌液接在濾紙片中央，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，取出觀測并記錄抑菌數(shù)據(jù)[16]。

1.2.3 芽孢桿菌固氮能力測定 將菌株WL81、WL911、WL92和WL99單菌落接種至 5 mL LB液體培養(yǎng)基中搖培14 h，作為菌懸液。在Ashby無氮固體培養(yǎng)基中央放置一個(gè)直徑為4 mm的濾紙小圓片；吸取5 μL菌懸液分別接種于濾紙片，在37 ℃條件下培養(yǎng)7 d。觀察并測量菌落的生長，根據(jù)所形成的透明圈大小，檢測其固氮能力[17]。

1.2.4 芽孢桿菌降解纖維素活性測定 在CMC培養(yǎng)基中央放置一個(gè)直徑4 mm的濾紙小圓片，分別吸取5 μL搖培后的WL81、WL911、WL92和WL99菌懸液點(diǎn)接在濾紙片中央，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后，取出后注入Gram碘染液，靜置4 min，倒去染液。測量并記錄透明圈及菌落直徑，確定比值A(chǔ)[18]。

1.2.5 芽孢桿菌耐逆性測定 耐鹽性測定：配制梯度NaCl的質(zhì)量濃度為0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15 kg/L的LB液體培養(yǎng)基，挑取4株菌株單菌落分別接種到不同濃度梯度的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，活化14 h；將100 μL菌液涂布于對應(yīng)鹽濃度的固體LB平板，倒置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5 d。每天觀察并記錄菌株生長和擴(kuò)展，測定菌株的耐鹽性[20]。

耐低溫測定：將4株菌株單菌落分別接種到含有5 mL低溫1C液體培養(yǎng)基的試管中，活化 14 h；取5 μL菌液接種在1C固體培養(yǎng)基上，以溫度梯度4、10、14、18 ℃下培養(yǎng)5 d。每天觀察并記錄生長情況，測定菌株的耐低溫性[6]。

1.2.6 芽孢桿菌分子鑒定 16S rDNA序列鑒定：菌株WL81、WL911、WL92和WL99的基因組DNA提取參照張瑞福等[21]方法進(jìn)行，利用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，反向引物1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)[22]，引物序列及供試菌的基因組DNA由上海美吉生物公司進(jìn)行合成并測序。將所獲得的拼接序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進(jìn)行在線比對，以MEGA 7.0(Mega Limited, Auckland, New Zealand)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

gyrB基因序列鑒定：利用正向引物UP(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGG NGGNAARTTYGA-3′)，反向引物UP2r(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGC CRTCNA CRTCNGCRTCNGTCAT-3′)[22]；引物序列及供試菌的基因組DNA由上海美吉生物公司進(jìn)行合成并測序。序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析同上述 方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌促紫花苜蓿生長效應(yīng)

菌懸液對紫花苜蓿幼苗灌根處理后培養(yǎng)7 d，紫花苜蓿幼苗生物量的測量結(jié)果表明，4株菌株對紫花苜蓿幼苗生長均具有促進(jìn)作用。其中，菌株WL911對紫花苜蓿幼苗生長的促進(jìn)作用最為顯著(P<0.05)，處理組的紫花苜蓿幼苗平均株高、根長、鮮質(zhì)量分別達(dá)到11.62 cm、6.67 cm、0.06 g，與對照組相比分別增加60.7%、100.8%、100.0%(圖1和表1)。4株菌株對紫花苜蓿幼苗的地上、地下部分及鮮質(zhì)量均具有促進(jìn)作用，可積累植物生物量。

表1 4株芽孢桿菌菌株促紫花苜蓿幼苗生長效率

A.對照；B.菌株WL81促紫花苜蓿生長；C.菌株WL911促紫花苜蓿生長；D.菌株WL92促紫花苜蓿生長；E.菌株WL99促紫花苜蓿生長

2.2 芽孢桿菌拮抗病原真菌活性

拮抗病原真菌活性測定結(jié)果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99對禾谷鐮孢、銳頂鐮孢、鏈格孢和黑曲霉均具有一定的拮抗活性。其中菌株WL911對4種病原真菌的抑菌圈直徑均在15 mm以上，較大程度抑制病原菌的生長和擴(kuò)散，表現(xiàn)出顯著拮抗活性。4株芽孢桿菌菌株對分離自不同植物的4種病原真菌均具有拮抗作用(圖2和表2)。

A.拮抗禾谷鐮孢；B.拮抗銳頂鐮孢；C.拮抗鏈格孢；D.拮抗黑曲霉

表2 4株芽孢桿菌菌株對病原真菌的拮抗活性

2.3 芽孢桿菌固氮能力

固氮能力測定結(jié)果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99均具有良好的固氮能力。將4株菌株接種于改良Ashby無氮固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)其均能產(chǎn)生透明圈，形成的透明圈直徑分別為20、29、23、22 mm，表明4株菌株均可在無氮培養(yǎng)基中正常生長(圖3)。

A.菌株WL81形成的透明圈；B.菌株WL911形成的透明圈；C.菌株WL92形成的透明圈；D.菌株WL99形成的透明圈

2.4 芽孢桿菌降解纖維素活性

降解纖維素活性測定結(jié)果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99均能夠降解纖維素。將4株菌株接種在CMC-Na培養(yǎng)基平板中央進(jìn)行培養(yǎng)，使用Gram Iodime染色后，均產(chǎn)生明顯的透明圈，其直徑分別為28、40、29、31 mm，說明芽孢桿菌產(chǎn)生纖維素酶將CMC-Na水解產(chǎn)生還原糖，使其無法附著染料而形成透明圈。其中，菌株WL911的降解纖維素活性最為明顯，其A值為3.33(圖4和表3)。

A.菌株WL81形成的透明圈；B.菌株WL911形成的透明圈；C.菌株WL92形成的透明圈；D.菌株WL99形成的透明圈

表3 4株芽孢桿菌菌株降解纖維素活性

2.5 芽孢桿菌的耐逆性

2.5.1 耐鹽性 耐鹽性測定結(jié)果表明，菌株WL81只能在鹽濃度為0.03、0.05、0.07、0.09、0.11 kg/L的培養(yǎng)基上生長，其余3株菌株在鹽濃度為0.13 kg/L培養(yǎng)基上均可正常生長，表現(xiàn)出良好的耐鹽性。其中，菌株WL911在鹽濃度為0.15 kg/L的LB固體培養(yǎng)基上可緩慢生長，表現(xiàn)出顯著的耐鹽特性(表4)。

2.5.2 耐低溫性 低溫適生測定結(jié)果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99培養(yǎng)在14 ℃、18 ℃條件下，1 d后均長出菌圈；10 ℃低溫時(shí)，菌株WL911和WL99生長和擴(kuò)展較快，培養(yǎng)3 d后即出現(xiàn)明顯的菌苔，菌株WL81和WL92培養(yǎng)第4天長出菌苔；4 ℃時(shí)，菌株WL911、WL92和WL99均可緩慢生長，培養(yǎng)第5天后出現(xiàn)少量菌苔，其余3株菌株不能生長。由此可見，菌株WL81、WL911、WL92和WL99具有良好的低溫適生性(表4)。

表4 4株芽孢桿菌菌株的耐鹽性及低溫適生性

2.6 芽孢桿菌的分子鑒定

2.6.1 16S rDNA序列鑒定 序列與GenBank中已知序列比對結(jié)果表明，菌株WL81與B.pumilusG10(登錄號(hào)：MK720406.1)的16S rDNA序列一致性為99%，菌株WL911與B.velezensisA2(登錄號(hào)：MG727659.1)的16S rDNA序列一致性為99%，菌株WL92與B.cereusLXJ11(登錄號(hào)：MN746202.1)的16S rDNA序列一致性為99%，菌株WL99與B.atrophaeusEGI61(登錄號(hào)：MN704536.1)的16S rDNA序列一致性為99%(表5)。構(gòu)建的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹表明4株供試菌株與已知菌株具有明顯的親緣關(guān)系(圖5)。

圖5 基于16Sr DNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6.2gyrB基因序列鑒定 序列與GenBank中已知序列比對結(jié)果表明，菌株WL81與B.pumilusKYC18(登錄號(hào)：HM585081.1)的gyrB基因序列一致性為99 %，菌株WL911與B.velezensisJK-XZ8(登錄號(hào)：MK192100.1)的gyrB基因序列序列一致性為99%，菌株WL92與B.cereusWPySW2(登錄號(hào)：CP053289.1)的gyrB基因序列一致性為99 %，菌株WL99與B.atrophaeusTGRG7(登錄號(hào)：MT984377.1)的gyrB基因序列序列一致性為99%(表5)。構(gòu)建的gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹表明4株供試菌株與已知菌株具有明顯的親緣關(guān)系(圖6)。

圖6 基于gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表5 4株芽孢桿菌菌株的16S rDNA和gyrB序列比對結(jié)果表

綜合16S rDNA及gyrB分子鑒定結(jié)果，菌株WL81鑒定為短小芽孢桿菌B.pumilus，菌株WL911鑒定為貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis，菌株WL92鑒定為蠟樣芽孢桿菌B.cereus，菌株WL99鑒定為萎縮芽孢桿菌B.atrophaeus。

3 討 論

高海拔地區(qū)的高寒草地長期受嚴(yán)寒、干旱等氣候的影響，加劇了草地退化、生態(tài)環(huán)境破壞、阻礙草地畜牧業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展[23]。紫花苜蓿作為栽培牧草，不僅可以提高退化草地恢復(fù)率，還可作為良好的粗飼料供家畜食用[24]。高原特殊的地理環(huán)境、氣候條件限制了紫花苜蓿的正常生長發(fā)育，同時(shí)，國內(nèi)報(bào)道紫花苜蓿易受銳頂鐮孢(F.acuminatum)等侵染，導(dǎo)致其固氮能力下降，產(chǎn)量下降[25]。因此，若將能夠在極端環(huán)境中生存的高原本土芽孢桿菌應(yīng)用到逆境條件下優(yōu)良牧草的生產(chǎn)中，以期增強(qiáng)牧草抗性，促進(jìn)牧草生長；同時(shí)，若將能夠降解纖維素的芽孢桿菌應(yīng)用于飼料加工及秸稈還田，以提高養(yǎng)分轉(zhuǎn)化率，為高寒地區(qū)生態(tài)恢復(fù)和畜牧業(yè)發(fā)展提供有力基礎(chǔ)。

芽孢桿菌是有益微生物中一種重要的生防細(xì)菌，其生長過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等物質(zhì)都對植物病原物具有抑制作用，可間接促進(jìn)植物生長[26]。本研究測定4株菌株拮抗病原真菌活性，結(jié)果表明4株菌株對分離自小麥(T.aestivum)的禾谷鐮孢(F.graminearum)、分離自梭羅草(R.thoroldiana)的銳頂鐮孢(F.acuminatum)、分離自老鸛草(G.wilfordii)的鏈格孢(A.alternata)、分離自高山嵩草(K.pygmaea)的黑曲霉(As.niger)均表現(xiàn)出良好的拮抗活性。渠露露等[27]研究發(fā)現(xiàn)對水稻(Oryzasativa)幼苗接種類芽孢桿菌菌株ZLT11能明顯提高其生物量，還可增強(qiáng)水稻應(yīng)對金屬Cd的脅迫抗性。本研究中將具有促生作用的芽孢桿菌菌株應(yīng)用到紫花苜蓿的生長中，通過其生物量的增長探究菌株的促生能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株WL911的促生效果最為突出，紫花苜蓿的平均株高、根長、鮮質(zhì)量與對照相比，均有明顯增長。芽孢桿菌屬是一類自生固氮微生物，可為植物的生長發(fā)育提供必需的氮元素，牛鑫斌等[28]報(bào)道類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)菌株W-7和L-3的固氮酶活性高，具有提高植物產(chǎn)量和改善土壤質(zhì)量的作用。本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)菌株均表現(xiàn)出良好的固氮能力，據(jù)此，將這些菌株應(yīng)用到促進(jìn)植物固氮中，對土壤氮素轉(zhuǎn)化及提高植物氮素養(yǎng)分具有重要意義。楊雪等[29]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)菌株DGL1體內(nèi)存在與降解纖維素相關(guān)的編碼基因CMCase，并通過KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/kegg/)注釋到與解纖維素有關(guān)的代謝途徑。本研究中4株芽孢桿菌菌株也均具有解纖維素活性，推測這些菌株體內(nèi)也可能產(chǎn)生纖維素酶，對植物細(xì)胞壁具有一定的分解作用，其應(yīng)用于牧草飼料加工、秸稈還田等方面，可提高養(yǎng)分吸收效率、秸稈利用率。潘晶等[30]研究認(rèn)為芽孢桿菌在與植物互作的過程中，通過調(diào)節(jié)自身耐鹽基因的表達(dá)以多種作用方式提高植物的耐鹽性，促進(jìn)植物的生長。本研究表明4株芽孢桿菌菌株也具有一定的耐鹽、低溫適生性，推測其體內(nèi)可能具有耐鹽、耐低溫基因，對高原特殊環(huán)境具有一定的耐受力，可緩解逆境對植物造成的損害。

本研究中的4株芽孢桿菌菌株存在促進(jìn)優(yōu)質(zhì)牧草紫花苜蓿生長，拮抗多種牧草病原真菌、固氮及降解纖維素活性及較強(qiáng)的抗逆性的潛力。一方面，通過抑制病原物對植物的侵害、間接促進(jìn)植物生長；可定殖在植物根圍固定氮素、為其提供養(yǎng)分，促進(jìn)植物生長；通過降解纖維素的方式，提高牧草適口性、促進(jìn)草牧業(yè)發(fā)展。另一方面，對高原極端生境脅迫有更好的適應(yīng)性。篩選優(yōu)良生物學(xué)性狀的生防芽孢桿菌菌源對提高牧草抗病、加速牧草生長，飼草料加工生產(chǎn)等方面都具有極為重要的意義，為高原植被恢復(fù)、畜牧業(yè)持續(xù)發(fā)展提供基礎(chǔ)條件。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)白刺根圍的芽孢桿菌菌株WL81、WL911、WL92和WL99不僅具有顯著的促生作用，兼具有良好的生防功能及耐逆性。菌株WL911對紫花苜蓿幼苗生長具有顯著的促生效果，4株菌株均表現(xiàn)出良好的拮抗植物病原真菌活性，具有一定的固氮能力及降解纖維素活性，也具有一定的耐鹽、低溫適生性，是良好的高原環(huán)境微生物資源。