油菜(Brassica napus)β-1,4-木糖基轉移酶基因 BnIRX14克隆、序列分析及亞細胞定位

董 云，吳旺澤，靳豐蔚，方 彥，劉婷婷，王 毅，徐一涌，楊曉明

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 作物研究所，蘭州 730070；2.西北師范大學 生命科學學院，蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學，省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，蘭州 730070)

糖基轉移酶(Glycosyltransferase，GTs)廣泛存在于原核生物、真核生物、古細菌及病毒中，具有催化蛋白質、糖類、脂質、激素、黃酮等物質進行糖基化的功能。通過糖基化反應能使特定的糖基集團從一些供體轉移到靶受體形成糖苷等次生代謝物[1-3]。另外，糖基轉移酶還能催化各類糖轉變?yōu)楦鞣N受體分子，改變受體分子的穩(wěn)定性，水溶性以及受體分子的生物活性和轉運能力，從而介導植物生長發(fā)育、次生物質代謝、生物及非生物脅迫響應[4-7]。在植物體內，免疫相關復合物如水楊酸、酚類化合物、硫配糖體等三萜類化合物合成的最后修飾步驟就是糖基化過程[8]。通過全基因組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)真核生物基因組里大概有1%的基因編碼糖基轉移酶。

目前，根據(jù)GT序列的相似度以及催化底物的特異性和催化產(chǎn)物的立體化學結構，在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫CAZy(carbohydrate-active enzyme database)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)114個糖基轉移酶家族(GT1～GT114)，其中GT1家族包含最多的家族成員[9]。NDP-戊糖和NDP-己糖是糖基轉移酶GT1家族大多成員的反應底物，其中UDP-糖基轉移酶(UGTs)是催化UDP-糖的糖基轉移酶。在模式植物擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)350多個糖基轉移酶基因[10]，在蕓薹屬物種甘藍型油菜(Brassicanapus)、甘藍(Brassicaoleracea)和白菜(Brassicarapa)中已經(jīng)分別鑒定251、154、140個UDP-糖基轉移酶基因[11]，這些糖基轉移酶主要參與次生代謝物質的合成、生物和非生物脅迫[12]。例如UGT73B3和UGT73B5在擬南芥中通過關聯(lián)茉莉酸和水楊酸來響應假單胞菌侵染[13]，擬南芥UGT85U1/2和UGT85V1能通過改變吲哚衍生物參與鹽與活性氧脅迫抗性[14]。UGT84F1被發(fā)現(xiàn)在甘藍型油菜中通過抑制芥子酸來響應非生物脅迫[15]。蔡明亮等[16]從貴州地方稻種平塘黑糯(O.sativassp.japonica)低溫轉錄組文庫中，篩選到一個響應低溫的糖基轉移酶基因OsCUGT1，初步的表達分析認為該基因能被低溫誘導，與日本晴(O.sativassp.nipponbare)栽培種相比，OsCUGT1序列具有豐富的SNP多態(tài)性。中藥材植物中，像黃酮類化合物、咖啡酸及其衍生物等次生代謝物，對藥性及藥材道地性極其重要，在這些次生代謝物的合成過程中，糖基轉移酶具有重要的作用[17]。例如在新疆紫草咖啡酸及其衍生物合成過程中，UDP-葡萄糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs)調節(jié)的苯丙烷途徑發(fā)揮了重要作用[18]。黃酮類化合物是三七重要的藥性成分，重組蛋白試驗發(fā)現(xiàn)三七糖基轉移酶PnUGT82在體外能催化黃酮7-O糖苷化產(chǎn)物的合成[19]。這些證據(jù)充分證明，糖基轉移酶在植物生長發(fā)育，尤其是生物、非生物脅迫中具有重要功能。因此深入了解油菜中糖基轉移酶的生物學功能，通過遺傳學和生物技術等手段提高油菜品質和逆境抗性具有重要的理論意義和應用價值。

油菜是中國重要的油料作物之一，同時也是發(fā)展生物能源的優(yōu)良經(jīng)濟作物[20]。油菜生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到高溫、干旱、凍害、病害、蟲害等逆境的影響，造成油菜產(chǎn)量和品質嚴重下降[21-22]。鑒定，挖掘抗逆相關的基因和QTL(quantitative trait locus，QTL),是分子標記輔助選育高抗油菜新品種的先決條件。但與傳統(tǒng)模式植物擬南芥和水稻等相比，在油菜中與品質和抗逆相關的基因功能研究相對落后。本研究利用 5′RACE和3′RACE技術從甘藍型油菜(BrasssicanapusL.)中擴增了β-1,4-木糖基轉移酶基因IRX14(IrregularX-ylem14)的5′端和3′端序列，拼接后獲得該基因的全長cDNA序列(NCBI登記號KP100641，命名為BnIRX14)，對其全序列進行生物信息學分析，并通過構建融合表達載體pCAMBIA-1300-IRX14-GFP，利用煙草瞬時表達系統(tǒng)進行BiFC亞細胞定位，為將來進一步研究β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX14在油菜次生物質代謝及逆境響應中的生物學功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 參試油菜為甘藍型(BrassicanapusL.)栽培品種‘Westar’，煙草為本氏煙草(Nicotianabenthamiana)。

1.1.2 菌株和載體 農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞DH5α、植物表達載體pCAMBIA1300-GFP、克隆載體pMD18-T Cloning Vector購自陜西博瑞德生物科技公司。

1.1.3 酶、試劑盒和主要的化學試劑 PCR聚合酶KOD FX Neo、膠回收試劑盒(OMEGA)、限制性內切酶KpnⅠ、HindⅢ、XbaⅠ,T4DNA Ligase購自陜西博瑞德生物科技公司; 5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒和Trizol均購自Invitrogen公司；SMARTerRMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒購自Clontech公司。

1.2 方 法

1.2.1 油菜總RNA的提取 油菜總RNA采用Trizol法提取，提取方法參考其說明書。

1.2.2 油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX14克隆 根據(jù)NCBI中已登記的甘藍型油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因保守區(qū)序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AJ971041.1)，設計 5′RACE和3′RACE引物，引物由上海生物工程公司合成，相關引物序列見表1。以總RNA為模板，使用5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒和SMARTer′ RACE cDNA Amplification Kit試劑盒分別進行5′端序列和3′端序列擴增，反轉錄及RACE擴增均參照試劑盒說明進行。將5′RACE和3′RACE第2輪PCR產(chǎn)物分別進行電泳，對目的片段的回收、連接、轉化[23]，挑取陽性克隆送上海生物工程公司測序。利用VectorNTI軟件拼接5′RACE和3′RACE擴增獲得的5′端、3′端片段序列和原來的保守區(qū)序列。

表1 5′ RACE和3′ RACE引物序列

1.2.3 油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX14生物信息學分析 利用ExPASy Proteomics Sever(http://expasy.org/)預測 BnIRX14氨基酸序列分子量和等電點[24]。利用NCBI中的Concserved Domain,NetNGlyc 1.0 Server,NetPhos 3.1 Server,SignalP-5.0 Server,TMHMM Server v.2.0,SWISS-MODEL,STRING分別進行BnIRX14蛋白保守性、糖基化位點、磷酸化位點、蛋白信號肽、跨膜結構、蛋白質三級結構和互作蛋白的預測；利用DNAMAN軟件同源比對蕓薹屬物種IRX14氨基酸序列。

1.2.4 油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX14融合表達載體構建 通過Vector NTI軟件查找拼接后基因全長的開放閱讀框，在起始密碼子和終止密碼子附近設計開放閱讀框的上下游引物P485F、P485R。因克隆的基因序列較長，為保證克隆的片段無突變，在序列中間設計引物P485MR、P485MF，分別與上下游引物配對進行PCR擴增，引物序列見表2。PCR反應體系：模板cDNA 1 μL，KOD FX Neo(1U/μL)1 μL，2× PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL，5′ primer(10 μmol/L)2 μL，3′ primer(10 μmol/L)2 μL，dNTP(2 mmol/L)10 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性5 min；循環(huán)為98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min 30 s，共30個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。參照膠回收試劑盒(OMEGA)、克隆載體pMD18-T的使用說明書回收目的片段，并分別與pMD18-T載體連接。按照董云等[25]的方法進行連接產(chǎn)物的轉化、質粒抽提，使用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定，雙酶切體系：10×BamHⅠ Buffer 4 μL，質粒DNA 2 μL，KpnⅠ或XbaⅠ(10 U/μL)1 μL，HindⅢ(10 U/μL)1 μL，ddH2O 12 μL。分別用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ，KpnⅠ和XbaⅠ將鑒定正確的重組質粒和植物表達載體pCAMBIA1300-GFP質粒進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行膠回收及純化(方法同前)。對膠回收的目的基因兩個片段及載體pCAMBIA1300-GFP大片段進行體外連接(圖1)、轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含Kan的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；再將轉化出來的單菌落通過搖菌后用485MF/485R進行菌液PCR鑒定，PCR鑒定正確的菌液送測序并保存菌液。

表2 克隆的相關引物序列

圖1 融合表達載體pCAMBIA1300-IRX14-GFP構建

1.2.5 油菜β-1,4-木糖基轉移酶BnIRX14亞細胞定位

參照郝麗芬等[26]的方法，構建的融合表達載體pCAMBIA1300-IRX14-GFP導入農(nóng)桿菌GV3101，并瞬時轉染本氏煙草葉片，侵染2～3 d后切取侵染區(qū)域，在FV10-ASW激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS)觀察亞細胞定位。

2 結果與分析

2.1 油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因 BnIRX14 克隆

根據(jù)NCBI中已登記的甘藍型油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因AJ971041.1保守區(qū)序列，設計5′RACE引物和3′RACE引物，使用5′RACE和3′RACE試劑盒分別擴增獲得223 bp和781 bp的β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX145′端片段(圖2-A)和3′端片段(圖2-B)。對β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX145′ 端和3′ 端的目的條帶分別進行切膠回收、純化，純化后的PCR產(chǎn)物分別與pMD18-T連接，轉化大腸桿菌后挑取陽性克隆測序，測序結果見圖2-C和2-D。測序正確后，利用 VectorNTI 軟件將克隆獲得的BnIRX14基因 5′ 端序列和3′ 端序列與保守區(qū)序列拼接，拼接后測序表明，油菜BnIRX14含有 1 566 bp 的完整開放閱讀框，編碼522個氨基酸，該基因命名為BnIRX14(NCBI登記號KP100641)。

A.5′端擴增片段；B.3′端擴增片段；C.5′端測序結果；D.3′端測序結果

2.2 油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因 IRX14生物信息學分析

利用測序氨基酸序列，同源比對蕓薹屬基因IRX14編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)與甘藍型油菜(BnaA07T0142000ZS)、白菜(Bra012145)、芥菜型油菜(BjuA011746)、甘藍(BolC07g023520.2J)和黑芥(BniB06g014750.2N)IRX14具有高度的相似性，相似性分別為 82.57%、81.78%、81.34%、72.25% 和 75.61%，與同科的擬南芥IRX14相似性為 74%。保守域結構比對發(fā)現(xiàn)，油菜BnIRX14具有 GTs 家族保守的 DxD 保守結構域(x表示除脯氨酸以外的任何氨基酸，或者沒有x)。BnIRX14還存在 UGT 糖基轉移酶一段由 44個 氨基酸組成的 PSPG(plant secondary product glycosyltransferase box)保守結構域(圖3)。在 ExPASy 預測，BnIRX14分子質量約 58.92 ku，由 8 315 個原子組成，分子式為 C2631H4168N742O753S21。正電荷殘基總數(shù)(精氨酸,賴氨酸)為 68，負電荷殘基總數(shù)(天冬氨酸,谷氨酸)為 53。脂肪指數(shù)為 31.14，親水性為-0.360，蛋白質不穩(wěn)定指數(shù)為53.98，因此推測該蛋白屬于不穩(wěn)定親水蛋白，屬于糖基轉移酶GT43家族成員(圖4-A)。

利用 Net NGlyc 1.0 Server 和 NetPhos 3.1 Server 預測油菜BnIRX14糖基化和磷酸化位點發(fā)現(xiàn)，BnIRX14蛋白中存在3個糖基化位點(96、192和314)(圖4-B)，多個磷酸化位點，從多到少依次為絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸，也存在糖原合成酶激酶3(GSK3)、細胞分裂周期激酶2(CDC2)、蛋白激酶(PKC)、絡蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、蛋白激酶A(PKA)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)等多種特異性蛋白激酶結合位點(圖4-C)，跨膜域預測表明，BnIRX14具有一個單次跨膜區(qū)，為膜蛋白(圖4-D)，不存在信號肽，屬非分泌性蛋白(圖4-E)。對 BnIRX14 蛋白結構進行預測分析，結果表明該蛋白二級結構中α螺旋結構(α-Helix)占29.17%，β片層(β-strand)占 5.95%，無規(guī)則卷曲(Randomcoil)占46.45%，延伸鏈占 18.43%。蛋白三級結構源建模使用的模板為人類 β-1,1-葡萄糖糖基轉移酶，其同源性為 29.09%(圖5-A)。以白菜基蛋白質數(shù)據(jù)庫作為參考，預測分析 BnIRX14 蛋白與其他蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn) BnIRX14 與白菜 Bra019618.1(擬南芥GUT1同源基因，催化葡糖醛酸基轉移酶)互作分數(shù)最高為 0.997；其次與白菜Bra039502.1(蔗糖裂解酶，為各種代謝提供UDP-葡萄糖和果糖)互作，參與生物催化反應；與 Bra037432.1,Bra036282.1 和 Bra006644.1等互作分數(shù)都達到 0.875 以上。這些預測的互作蛋白都與各類糖合成和轉運有關。同源比對和互作分析初步表明 BnIRX14 可能參與木糖的合成代謝過程(圖5-B)。

2.3 油菜β-1,4-木糖基轉移酶基因 BrIRX14融合表達載體構建

根據(jù)BnIRX14基因拼接序列設計的上下游引物P485F、P485R與序列中間設計的引物P485MR、P485MF分別配對，以油菜cDNA為模板進行PCR擴增。P485F/P485MR和P485MF/P485RPCR產(chǎn)物分別為727 bp和853 bp(圖6-A)，膠回收PCR擴增片段，分別與pMD18-T載體連接，經(jīng)菌液PCR檢測后選取陽性克隆，分別使用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定，切下的目的條帶分別為718 bp和845 bp(圖6-B)，送交測序驗證。測序驗證后用KpnⅠ和HindⅢ，HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切測序質粒載體，分別回收718 bp和845 bp的片段。同時用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切pCAMBIA1300-GFP質粒，膠回收、純化大片段，與回收的IRX14基因718 bp和845 bp的兩段雙酶切序列片段進行體外連接，隨后轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，用P485MF/P485R進行菌液PCR鑒定，陽性克隆測序驗證正確(圖6-C)。

圖6 融合表達載體 pCAMBIA1300-IRX14-GFP構建及陽性克隆PCR鑒定

2.4 油菜β-1,4-木糖基轉移酶IRX14亞細胞 定位

將構建的融合表達載體pCAMBIA1300-IRX14-GFP和空載體pCAMBIA1300-GFP分別轉化農(nóng)桿菌GV3101，將活化的農(nóng)桿菌注射煙草葉片，22 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)2 d后利用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的分布情況。由圖7可見，pCAMBIA1300-IRX14-GFP的熒光信號主要分布在細胞質中，而對照pCAMBIA1300-GFP在細胞核和細胞質中均觀察到綠色熒光信號，BiFC結果表明β-1,4-木糖基轉移酶BnIRX14定位于細胞質。

圖7 甘藍型油菜β-1,4-木糖基轉移酶BnIRX14亞細胞定位

3 討 論

干旱、鹽害、極端溫度、病蟲害等非生物和生物脅迫嚴重影響油菜生長發(fā)育和油菜品質，提高油菜逆境抗性，保持穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)質是當前油菜生產(chǎn)亟待解決的問題。篩選、鑒定與油菜抗逆相關的基因和QTL，揭示其逆境響應分子機制，對培育抗逆性油菜新品種具有重要的經(jīng)濟意義[27-28]。擬南芥IRX9(At2g37090)、I9H(At1g27600)、IRX14(At4g36890)、I14H(At5g67230)屬于糖基轉移酶GT43家族成員，I9H和I14H在植物組織各器官均有表達，IRX9和IRX14主要在花序和莖中表達。IRX9和IRX14在擬南芥木糖合成中扮演著重要的角色，IRX9和IRX14功能缺失型突變體導致木糖含量降低，生長發(fā)育異常[29]。棉花中，GhGT43A1 和GhGT43C1 屬于糖基轉移酶GT43家族蛋白，與擬南芥IRX9 和IRX14緊密相關，它們參與棉花纖維發(fā)育中木糖的合成，GhGT43A1主要在開花后15～20 d的棉纖維中高效表達，但是GhGT43C1卻在根莖葉等中廣譜表達[30]。這些結果表明，雖然糖基轉移酶GT43家族成員進化高度保守，但也具有生物功能多樣性。糖基轉移酶不僅與植物逆境脅迫響應相關，同時還參與植物體內防御復合物的糖基化修飾，改善其生物活性和溶解度來增強植物抗逆性，因此糖基轉移酶已成為近年的研究熱點。高世超等[31]、周佩娜等[32]分別從青花菜、霍山石斛中克隆得到β-1,4-木糖基轉移酶基因IRX9H、IRX9，生物信息學分析表明IRX9H、IRX9基因編碼蛋白均為無信號肽蛋白，并對β-1,4-木糖基轉移酶基因IRX9H研究表明在青花菜抗酸雨脅迫中發(fā)揮作用。

本研究通過同源搜索比較，利用RACE技術從甘藍型油菜中克隆到β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX14(NCBI登記號KP100641)。BnIRX14基因具有1 566 bp的完整開放閱讀框，編碼522氨基酸，其編碼的蛋白質無信號肽存在。保守域結構預測，BnIRX14具有UGT糖基轉移酶PSPG保守結構域，并具有GTs家族保守的DxD結構域。大多數(shù)含有GT-A折疊的GTs家族蛋白都存在DxD保守結構域，是糖基轉移酶催化活性的重要結構域，二價陽離子可以與該結構域配位，以穩(wěn)定結合核苷酸糖[33]。進化樹統(tǒng)計分析，BnIRX14與十字花科蕓薹屬物種白菜、芥菜型油菜、甘藍和黑芥IRX14相似性達到72% 以上，說明本研究通過RACE技術克隆的甘藍型油菜BnIRX14屬于糖基轉移酶GT43家族成員。擬南芥I9H(IRX9同源基因)和IR14H(IRX14同源基因)TMHMM預測具有單次跨膜結構域，構建YFP標簽的亞細胞準確定位表明 I9H和IR14H定位在高爾基體中[29]；霍山石斛GT43家族成員IRX9 TMHMM預測也具有單次跨膜結構域，PSORT的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)霍山石斛IRX9定位于微粒體分值最高[31]。BnIRX14 TMHMM預測也是單次跨膜蛋白，BnIRX14-GFP亞細胞定位表明，BnIRX14定位于細胞質中，但目前的BiFC試驗還不能準確確定BnIRX14是否也定位于高爾基體中，后期需要通過細胞器特異熒光染料來確定BnIRX14的準確定位。蛋白結構域預測，BnIRX14具有單次跨膜結構域，該結果與前人研究結果一致[33]。糖基化和磷酸化位點是糖基轉移酶生物學功能的重要催化活性位點，BnIRX14預測也發(fā)現(xiàn)多個糖基化和磷酸化位點，可能與其他催化葡糖醛酸基轉移酶的蛋白相互作用調控木糖的合成，從而來調節(jié)生長發(fā)育和逆境響應。具體BnIRX14如何參與油菜的生長發(fā)育和逆境響應還需要深入的試驗來證實。目前，通過RACE從油菜中克隆到情況BnIRX14，為深入研究BnIRX14的生物學功能奠定基礎，為將來通過生物技術手段培育高抗的油菜品種提供理論和技術支持。

4 結 論

本研究利用5′RACE與3′RACE方法從甘藍型油菜中擴增獲得β-1,4-木糖基轉移酶基因BnIRX14，該基因cDNA全長1 566 bp，編碼522個氨基酸，具有多個糖基化和磷酸化位點。初步的BiFC結果表明BnIRX14定位在細胞質中，BnIRX14具有GTs家族基因典型的DxD特征結構域，屬于油菜GT43糖基轉移酶家族成員。