‘新番72號’加工番茄定點突變的耐貯性初步探討

張西英，劉江娜，李榮霞,薛麗萍，白云鳳，張愛萍

(新疆生產建設兵團 第六師農業科學研究所，新疆五家渠 831300)

新疆是中國主要的加工番茄種植基地，其機械采收已達到70%以上。由于番茄果實易過熟軟化，致使耐壓性能變差、抗病原菌能力降低，已嚴重影響到生產、貯運及加工品質[1]。培育抗軟化、耐貯運的番茄新品種對新疆加工番茄的種植及加工產業的發展具有重要意義。

利用常規育種方法改良番茄品種周期長，易受不良基因連鎖和種間生殖隔離的限制[2]。近年來，以多種新型高效的DNA靶向內切酶為基礎建立的基因組編輯技術(Voytas，2013)，可以在不同物種中對目標基因進行定點敲除、單核苷酸或多核苷酸片段置換、添加等靶向修飾，不必通過導入反義基因或RNAi基因抑制靶基因功能[3-6]。在各種基因編輯技術中，CRISPR/Cas9技術操作較為簡單、高效，應用更為廣泛[7-10]，CRISPR-Cas9系統對目標基因進行精確的原位編輯后，不必再通過轉基因調控目標基因功能，而由于sgRNA-Cas9基因的整合位點和編輯位點是分離的，因此可通過自交分離剔除sgRNA-Cas9基因，獲得無轉基因序列的新種質，比常規轉基因技術安全可靠。基因編輯修飾的基因只有少數核苷酸改變，與自然突變或人工理化誘變本質相同，而在效率和可控性方面則遠遠優于誘變育種[11]。

番茄基因組較小，已完成了全基因組精細序列分析，為通過全基因組層面掃描、篩選出高特異性 sgRNA 以規避脫靶效應提供了可靠的基因組序列和遺傳背景，且遺傳轉化體系也已成熟。迄今利用CRISPR-Cas9系統改良番茄農藝性狀的報道較少。番茄是二倍體自花授粉作物，利用CRISPR-Cas9系統原位定點修飾乙烯代謝相關基因以遲滯番茄過熟腐爛，并通過自交分離剔除外源DNA序列，獲得無轉基因序列的耐貯運新種質，為加工番茄新品種培育和功能基因研究提供技術支撐，也將為利用CRISPR-Cas9系統改良番茄其他農藝性狀做出有益探索。

1 材料與方法

1.1 材 料

番茄品種為‘新番72號’，由新疆生產建設兵團第六師農科所番茄課題組選育提供。母本‘A-10’ 是從‘里格爾87-5’中篩選出綜合抗性好的株系，經過8代自交提純得到的穩定材料，屬早熟加工番茄品種；父本‘MG-01’是從國外引進的加工番茄材料‘JQ-23’，經7代分離、純化得到的穩定、早熟品系，以番茄的下胚軸和子葉為外植體，農桿菌介導轉化。

1.2 方 法

番茄為呼吸躍變型果實，伴隨呼吸躍變產生大量乙烯，即系統Ⅱ乙烯，易使番茄果實過熟，腐爛變質。1-氨基環丙烷1-羧酸ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid)是合成乙烯的直接前體，ACC合酶ACS(ACCsynthase)是乙烯合成的限速酶，由多基因家族編碼，SlACS1和SlACS6等主導系統I乙烯的合成，SlACS2和SlACS4主導系統Ⅱ乙烯的合成。利用多種信息學工具從SlACS2基因上游的編碼區篩選出高特異性sgRNA，通過CRISPR-Cas9基因組編輯系統僅對SlACS2基因進行定點突變，調控系統Ⅱ乙烯過量表達，而不影響SlACS家族其他基因序列，以保證番茄正常生長發育，又適度抑制系統Ⅱ乙烯的生成，以期遲滯番茄過熟腐爛。

1.2.1 SlACS2sgRNA的設計和選擇 克隆待改良加工番茄品種‘新番72號’等的SlACS2基因cDNA，以此作query進行BLAST，確定SlACS2的基因組結構以及外顯子所在染色體位置，規避設計的sgRNA被內含子相隔而成為無效sgRNA。根據CRISPR-Cas9靶點設計原則，利用CRISPRdirect篩選SlACS2第1、2外顯子區域的sgRNA序列，sgRNA的結構設定為5′-(N)20NGG-3′，N為任意核苷酸。利用CRISPR-P驗證sgRNA的靶向特異性，篩選出靶向特異性好的sgRNA。

1.2.2 突變株的獲得和突變類型的研究 以番茄的下胚軸和子葉為外植體，農桿菌介導轉化，抗性篩選和分子檢測獲得T0代轉基因陽性植株，然后篩選獲得T0代突變植株自交結實后得到的T1代種子，將T1代種子播種成苗后提取葉片基因組DNA特異性引物檢測，確定突變類型，并篩選純合突變植株。

2 結果與分析

2.1 基于RNA-seq的 SlACS2數字表達譜

以番茄功能基因組數據庫網站(http://ted.Bti.ornell.edu/cgi-bin/)中 RNA-seq data 的數據作基礎，建立SlACS2基因的基于 RNA-seq 的數字表達譜(圖1)。

1.子房;2.半綠果實;3.成熟綠果實;4.破色期果實;5.成熟紅果實;6.0～3 mm花蕾;7.3～8 mm花蕾;8.8 mm開花前花蕾;9.完全展開花;10.發育階段花的混合物;11.野生番茄花粉;12.感染假單胞菌葉片;13.假單胞菌葉片;14.混合誘導葉片;15.4～6周齡植株的頂端分生組織;16.8周齡植株頂端分生組織;17.花前根;18.掛果期根;19.營養匱乏的根;20.完全吸漲5 d后的胚根;21.完全吸漲7 d后的幼苗;22.休眠種子;23.愈傷組織；PRKM.每百萬reads中來自于特定基因每千堿基長度的reads數

結果顯示：SlACS2在番茄的子房、愈傷組織中有低水平表達，在破色期果實、成熟的紅果實中有較高水平的表達。證實了SlACS2是與果實成熟相關的基因，利用CRISPR-Cas9技術對該基因進行原位編輯，可能會減緩番茄內源乙烯的產生，遲滯番茄過熟，提高儲運品質。

2.2 同源克隆新疆番茄 ACS2基因

以 cDNA 為模板，在 NCBI 上對序列進行查找和分析，設計引物，如表1所示，進行ACS2基因序列的擴增。

表1 目的基因擴增引物

擴增后對目的基因進行回收與純化。先對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下含有目的片段的凝膠，用 DNA 凝膠回收盒回收測序。利用DNAman進行序列比對，克隆基因與NM_001247249.2完全一致，見圖2。同時，新疆番茄acs2基因的cds及編輯位點見圖3。

圖2 DNAman序列比對結果

圖3 新疆番茄 acs2基因的cds及編輯位點

2.3 SlACS2染色體定位和基因組結構

以SlACS2的cds作query，對NCBI番茄基因組數據庫進行Blast，結果表明，由圖4可知，SlACSgDNA位于番茄的1號染色體(GenBankAccession:NC_015438.2)，位置在 884 560 11～884 534 90 nt之間，長度2 522 nt，由4個外顯子、3個內含子組成，前3個外顯子較短，位于SlACS2的5′端，可在每個外顯子區域設計sgRNA，規避sgRNA分布在外顯子和內含子連接處。

圖4 SlACS2染色體定位和基因組結構

2.4 sgRNA的設計和選擇

根據CRISPR-Cas9靶點設計原則，利用CRISPRdirect(https://crispr.dbcls.jp/)篩選SlACS2外顯子區域的sgRNA序列，即3′端有PAM元件的20個連續的堿基序列，PAM元件設定為NGG，sgRNA的結構為5′-(N)20NGG-3′，N為任意核苷酸。利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)對sgRNA的靶向特異性進行綜合評分，由表2、3可知，綜合得分在 29～49。

根據CRISPRdirect在線分析，由表2可見，在第1外顯子的sgRNA中，有9條含有連續的TTTT序列，可排除。sgRNA1-2的GC含量低，sgRNA1-7在5號染色體上也有完全匹配的序列，易產生脫靶效應。在剩余7條sgRNA中，位于外顯子132～154 nt的sgRNA1-14特異性最好，該sgRNA和它包含的對特異性起重要作用的、鄰近PAM的12 nt種子序列在番茄基因組上都是唯一序列，沒有與之完全匹配的序列。sgRNA1-14的GC含量較高，靶向特異性綜合得分也較高，可為優選sgRNA。由表3可見，第2外顯子有9條sgRNA序列，其GC含量均低于35%，臨近PAM12nt的種子序列的脫靶位點在2個以上，沒有合適的sgRNA可以選擇。

表2 SIACS2基因第1外顯子含有的sgRNAs

表3 SIACS2基因第2外顯子含有的sgRNAs

2.5 番茄遺傳轉化體系的建立

對加工番茄‘新番72號’的種子消毒處理后置于1/2培養基上發芽，獲得無菌苗。通過苗齡、外植體對番茄愈傷組織及不定芽誘導的影響和不同激素濃度配比對愈傷組織和芽分化誘導的影響，最終篩選建立了無菌苗快繁再生體系(圖5)。

圖5 番茄無菌苗

通過對農桿菌濃度、侵染時間、共培養時間等方面對番茄遺傳轉化率的影響進行研究，篩選出適宜的轉化條件。最終通過多次篩選試驗，確定了農桿菌OD600為0.6～0.8為宜，以0.7最佳，預培養2 d，侵染時間為15 min，侵染后暗培養一夜的最佳轉化條件(圖6)。

圖6 番茄遺傳轉化再生植株

將與農桿菌共侵染后的愈傷組織分別放入含有 Kan的篩選培養基中進行初步篩選培養，在篩選過程中，首先用20 mg/L Kan的篩選培養基上培養15 d后，轉接至40 mg/L Kan篩選培養基上培養20 d，最終在60 mg/L Kan篩選培養基上培養，這樣即能保證轉化的愈傷組織正常分化，分化出的抗性不定芽生長正常，也可減少逃逸芽的產生(圖7)。

圖7 抗性篩選

2.6 Cas9轉基因番茄再生植株的PCR檢測及編輯植株分子鑒定

以質粒pSlACS2-DsgRNA為陽性對照，以野生型加工番茄‘新番72號’為陰性對照，利用CTAB法提取T0代植株的DNA，通過表4中的篩選引物，對獲得的21個抗性再生植株以Cas9特異引物進行PCR擴增檢測是否將CAS9系統成功轉入，其中7株擴增出了大小為 841 bp 的目的條帶，與陽性對照一致，未轉化的野生植株未擴增出目的條帶，見圖8，初步表明基因已經整合到轉化受體基因組中。PCR 擴增體系為：基因組 DNA 1 μL，PremixTaqDNA 聚合酶 Mix 10 μL，前后引物各 0.8 μL，加雙蒸水至 20 μL；PCR 擴增條件分別為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；35 個循環；72 ℃ 5 min，PCR 產物的大小通過 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳得到。

M.DL2000 DNA Marker; +.陽性質粒; WT(-).陰性對照; 1～4.轉基因抗性植株

表4 篩選PCR引物

2.7 SlACS2基因編輯植株的初步分子鑒定

將收獲的T0代突變株自交結實的T1代種子播種于大田中，提取溫室內T1代植株DNA，利用表5中的特異引物進行PCR擴增，使用靶位點特異引物進行PCR擴增、測序及比對分析，確定編輯突變體的突變類型，并篩選純合突變單株。目前試驗共完成394份植株的測序工作，從中篩選出無T-DNA的突變株6個，根據測序結果明確了不同植株的突變類型，對測序結果進行歸納總結，其中357個植株發生突變，突變率為 90.6%，純合突變率為36.8%。

表5 篩選PCR引物

通過調查得到種子萌發率、苗期生長情況及采摘期果實發育情況等相關指標，初步明確不同突變類型會對加工番茄生長和果實發育產生影響，同一突變類型表現型也不盡相同。由圖9可見，以SgRNA2處缺失7個堿基的突變類型為例，在統計過程中發現，株型多數發育不正常，表現為株型小葉片卷曲，果實發育也不正常，果型小多為裂果，但也有少數植株生長發育正常，果型正常結果多、成熟好。

圖9 SgRNA2處缺失7個堿基

3 討論與結論

果實過熟導致軟化腐爛是影響新疆加工番茄種植貯運及加工品質的重要限制因素。而常規雜交育種改良周期長，可利用的種質資源有限；理化誘變難以控制突變方向，突變位點鑒定困難；常規基因工程易使民眾產生安全性疑慮等諸多限制因素[12-14]。通過CRISPR-Cas9這一新型基因組定點編輯系統用于番茄耐貯性能改良，通過對SlACS2基因特定位點進行精準修飾，同時不影響SlACS基因其他家族基因序列，遲滯果實過熟軟化，提高耐貯運性能，從根本上解決加工番茄貯藏時間短、不耐運輸、嚴重影響加工品質等諸多問題；利用Cas9基因整合位點和編輯位點相互獨立的特點，通過遺傳分離，剔出T-DNA序列，獲得無轉基因組分的耐貯運新種質。這一技術較雜交育種周期短，較誘變育種定向性好，較常規基因工程安全性高，將為加工番茄的遺傳改良建立一個高效安全的技術體系。

番茄是植物學研究的經典模式系統之一，已經完成了全基因組精細序列分析，通過突變體揭示基因功能成為重要研究內容[15-18]。建立加工番茄有效的基因敲除技術體系，可促進其基因功能的研究發展，完善加工番茄CRISPR-Cas9基因編輯系統將為加工番茄基因功能研究、改良其他農藝性狀、培育新品種提供新的平臺和技術支撐，具有較大的應用前景。