中藥復方對斷奶幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌混合型腹瀉的預防效果

吳 婕，蔣詩琪，黃 雨，夏耀輝，任東娜，馮世秀，任戰軍

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.深圳市南亞熱帶植物多樣性重點實驗室，廣東深圳 518004)

細菌性腹瀉是規模化養殖兔時的多見病[1]，其首要的致病菌為大腸桿菌、魏氏梭菌等兔場常見菌[2]，幼兔感染后發病迅速、癥狀危急，有極高病死率[3-4]。同時感染多種致病菌的腹瀉幼兔病情比單種致病菌型更嚴重、更難根治[5]。飼糧中添加中藥可有效防治兔腹瀉類疾?。很绮?、白頭翁、苦參、馬齒莧等主配的復方可防治兔大腸桿菌病[6]，白頭翁、生姜、石榴皮、甘草可用于初期治療兔魏氏梭菌型腹瀉[7]。本研究中的中藥復方含茜草、白頭翁、苦參、馬齒莧等均具抗菌消炎、提高免疫力等功效的藥材[8-18]，但其防治幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌型腹瀉的成效亟待考證。

本試驗測定幼兔攝入含不同比例中藥復方的飼糧，遭遇攻毒后腹瀉率、免疫因子水平、盲腸菌群上的差異，探究該復方預防幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌型腹瀉的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

致病性大腸桿菌O1、兔致病A型魏氏梭菌由西北農林科技大學動物醫學院饋贈。

中藥復方由深圳市南亞熱帶植物多樣性重點實驗室配伍并提供，組分為：茜草、白頭翁、苦參、馬齒莧、板藍根、蒲公英、大青葉、茯苓、蒼術、黃連、黃柏。

1.2 動物處理

選擇體質量相近、公母各半、健康無病的 (45±2)日齡伊拉幼兔32只，隨機分為對照組、攻毒組(Ⅰ)、0.5 % 中藥組(Ⅱ)、1.0 % 中藥組(Ⅲ)，每組8只，每只記為1重復。試驗期第1～7 d，對照組、Ⅰ組幼兔提供基礎飼糧；Ⅱ、Ⅲ組分別在飼糧中添加0.5 %、1.0 %中藥復方。第8日施以攻毒：對照組腹腔注射8 mL生理鹽水，其余各組腹腔注射8 mL菌液(含大腸桿菌、魏氏梭菌各 4×109CFU)，各組飼糧不變。第14日處死存活幼兔，采集脾臟及盲腸內容物。

1.3 盲腸菌群16S rDNA擴增子測序

使用OMEGA E.Z.N.A.○RStoll DNA Kit提取幼兔盲腸菌群總DNA；委托諾禾致源公司，基于IonS5TMXL測序平臺進行16S rDNA V4區域的擴增、構建文庫及測序。去除原始讀取中的嵌合體及低質量讀取，并以97%的一致性水平進行OTUs聚類；進行物種注釋及豐度分析以比較組間Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數與門屬優勢菌群水平。

1.4 腹瀉率的測定

記錄各組攻毒后48 h內的腹瀉情況。腹瀉率=總腹瀉天數/(8×總天數)×100%。

1.5 免疫指標的測定

參照兔sIgA、IgA、IgM、hs-CRP酶聯免疫試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)步驟，檢測各組脾臟以上免疫因子的表達水平。

1.6 數據統計與分析

使用excel 2016對數據進行初步記錄歸納；免疫因子水平通過SPSS 21.0進行單因素方差檢驗(ANOVA)，用LSD法進行多重比較，并用“平均值±標準差”表示；其他數據使用組內平均值 表示。

2 結果與分析

2.1 中藥復方對幼兔腸道菌群的影響

2.1.1 α多樣性分析 由表1 可知，各組的凈讀數在79 586～80 678以內，覆蓋度范圍在0.92～0.95，表明測序中對各試驗組的檢測程度一致，并檢測出了絕大多數的序列；Ⅰ組的Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數普遍低于對照組，表明腹瀉幼兔腸道微生物物種的多樣性和豐富度低于健康幼兔；Ⅱ組的α多樣性指數均高于Ⅰ組，Ⅲ組的Shannon、Simpson指數高于Ⅰ組，表明中藥組幼兔腸道菌群的多樣性均高于腹瀉幼兔，且Ⅱ組的腸道菌群比Ⅲ組更豐富，體現出更好的治療效果。

表1 各處理中的測序信息及α多樣性指數Table 1 Information of sequencing and α diversity indices under different treatments

2.1.2 門屬水平優勢菌群的組成與結構 由表 2 可知，各組門水平上的優勢菌群以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)為主，占盲腸微生物集落的82.97%～87.40%，這表明各組優勢菌門的結構與含量總體相近；Ⅰ組疣微菌門的相對水平顯著低于對照組和Ⅱ組(P<0.05)。各組屬水平上的優勢菌群均為乳頭桿菌屬(Papillibacter)、Akkermansia屬、不明瘤胃菌科(unidentified_Ruminococcaceae)、不明腸桿菌科(unidentified_Enterobacteriaceae)、擬桿菌屬(Bacteroides)。在幼兔中，擬桿菌屬、Akkermansia屬是腸道有益菌群，不明腸桿菌科為有害菌群。與對照組相比，Ⅰ組Akkermansia屬的比例顯著降低(P<0.05)，不明腸桿菌科的相對含量上升(P>0.05)；Ⅱ組Akkermansia屬的相對豐度上升、不明腸桿菌科的豐度降低(P> 0.05)，擬桿菌屬的相對含量顯著上升 (P<0.05)。Ⅱ組Akkermansia屬、擬桿菌屬的比例均顯著高于Ⅰ組，不明腸桿菌科顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅲ組優勢菌屬的相對豐度普遍處于Ⅰ、Ⅱ組之間的水平。Akkermansia屬是疣微菌門的主要菌群，門屬菌群水平的豐度分析揭示各組Akkermansia屬與疣微菌門一致的變化趨勢，同時表明Akkermansia屬對維持幼兔的腸道環境穩態、抵御病原體的侵襲有重要意義；Ⅱ組有效改善了有益菌、有害菌的相對水平，相比Ⅲ組更早恢復腸道菌群穩態。

表2 腹瀉幼兔盲腸門水平與屬水平上的優勢菌群相對豐度差異Table 2 Differences in relative abundance of dominant cecum bacteria in diarrheal rabbits at levels of phylum and genus %

2.2 中藥復方對攻毒幼兔腹瀉率的影響

對照組在48 h內無腹瀉幼兔，其余各組均有幼兔表征腹瀉。24 h內，Ⅰ組腹瀉率為100%；Ⅱ、Ⅲ組腹瀉率均為25%；48 h內，Ⅱ 組腹瀉率為31.25%，Ⅲ組腹瀉率為37.5%，表明中藥復方對幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌混合腹瀉有顯著的預防效果。Ⅰ組幼兔在48 h內均死亡；Ⅱ、Ⅲ組腹瀉幼兔分別在4、3 d內死亡，表明該中藥復方對腹瀉幼兔的病情有一定的緩解作用。

2.3 中藥復方對腹瀉幼兔免疫指標的影響

由表 3可知，Ⅱ組的IgM、SIgA、hs-CRP水平極顯著升高，Ⅲ組的IgM、IgA、SIgA、hs-CRP水平均極顯著升高(P<0.01)。此外，Ⅱ組的SIgA水平極顯著高于Ⅲ組(P<0.01)。該結果表明飼喂中藥可顯著提升幼兔的免疫能力。

表3 中藥提取物對試驗組幼兔免疫因子的影響Table 3 Immune factors in experimental groups under different treatments of Chinese herbal medicine μg/mL

3 討 論

養殖戶預防幼兔腹瀉的措施常為接種各類疫苗，或飼喂抗生素，前者耗費大量人力物力，后者易因長期濫用抗生素使病菌的耐藥性提升，不利于養殖場的長期防疫[19-20]。飼料添加劑“限抗禁抗”迫使人們尋求高效安全的抗生素替代物。本研究選取的中草藥均為本土常見藥材。中藥可通過改變腸道微生物比例達到治療目的，其機制可為防治幼兔細菌性腹瀉提供思路[21-22]。中藥復方的活性成分復雜，多為生物堿、酮類等化合物，味微苦，對動物的適口性有一定影響，故在攻毒前有7 d的預飼期供幼兔適應采食[23]。飼糧中添加0.5%、1%的中藥劑量在已有研究中證實對動物采食量無顯著差異[23]；在本試驗前7 d的預飼期中，0.5%、1%中藥組幼兔的采食量與對照組和攻毒組相比均無明顯變化，表明添加0.5%、1%水平中藥的飼糧適口性良好，不影響幼兔的充分采食。

3.1 中藥復方對幼兔腸道菌群的影響

盲腸菌群α多樣性指數反映腸道微生物的豐度、均勻度、復雜度等信息，其數值越高代表微生物類群的復雜度和多樣性越高、腸菌平衡越趨于穩定[24]。健康動物的腸道菌群α多樣性指數普遍高于患腸道疾病的動物[25]。在本試驗中，攻毒組腹瀉幼兔的α多樣性指數低于對照組健康幼兔，其腸道狀態與腹瀉幼兔相符；Ⅱ組的α多樣性指數與對照組持平，說明飼糧中添加0.5%中藥可更好地改善幼兔的腸道環境。

對照組的門屬水平均與前人研究中的幼兔盲腸微生物組成結構相一致[26-27]。擬桿菌屬、Akkermansia屬是健康宿主腸道附殖的有益菌群：擬桿菌屬可分解膳食纖維中的阿拉伯木聚糖，增強宿主的免疫反應；Akkermansia屬分解宿主腸道粘膜的粘蛋白，可調節宿主代謝，利于宿主抵御腸道炎癥[28-30]。不明腸桿菌科是宿主腸道中的有害菌群，腹瀉仔豬腸道菌群中不明腸桿菌科的比例上升[31-33]。在本試驗中，腹瀉幼兔盲腸菌落中有益菌受抑制，有害菌過度增殖，加劇了腸道環境的失衡；而中藥通過調節攻毒幼兔腸道中有益菌和有害菌的比例，有效抵御致病菌的侵襲。

3.2 中藥復方對攻毒幼兔腹瀉率的影響

構建動物腹瀉模型可循肌肉注射、腹腔注射、口服灌注等攻毒手段[34]。腹腔注射菌液后的動物病情發生較早、腹瀉程度偏重，與生產中幼兔急性腹瀉相似，故本試驗結合已有文獻與預試驗攻毒結果，選擇幼兔腹瀉率最高、攻毒后24 h內無死亡的攻毒劑量建立大腸桿菌-魏氏梭菌腹瀉模型[6,34-35]。Ⅱ、Ⅲ組幼兔的腹瀉率遠低于Ⅰ組，表明添加兩種比例的中藥均可有效預防腹瀉。

3.3 中藥復方對腹瀉幼兔免疫指標的影響

IgM是機體防御病原體的第一批“衛士”[36]。SIgA于機體胃腸道、呼吸道等粘膜表面有最高水平，可提升腸粘膜附殖微生物群落多樣性、抑制促炎菌群比例[37-40]。SIgA包被斷奶小鼠、牛、豬的胃腸道中近70%的共生菌群，增進維持腸道菌群-腸粘膜的穩態[41]。IgA缺陷小鼠免疫系統發生紊亂，對腸道共生菌群亦會產生全身性炎癥反應[42]。Hs-CRP是炎性因子刺激時機體響應的超敏C-反應蛋白，常作為急性炎癥的標記物[43]。本試驗中Ⅱ、Ⅲ組的IgM、SIgA、Hs-CRP水平極顯著高于Ⅰ組，且Ⅱ組的SIgA水平極顯著高于Ⅲ組，說明飼糧中添加0.5%、1%的中藥可有效提升幼兔的免疫能力，且SIgA在兩菌混合感染幼兔的過程中起重要抵御作用。

4 結 論

混合感染大腸桿菌、魏氏梭菌的腹瀉幼兔盲腸微生物環境被破壞，有益菌的相對含量減少、有害菌的相對含量增加。0.5%水平的中藥復方可改善腸道菌群中有益菌與有害菌的水平，提高幼兔的免疫力，預防大腸桿菌-魏氏梭菌型腹瀉的效果更佳。