43份漢中茶樹種質資源葉片解剖結構分析

李 佼，李豆豆，王 令，吳軍艦，席彥軍，王思梅，蒲國濤，陳 欽

(1.漢中市農業技術推廣與培訓中心，陜西漢中 723000；2.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西漢中 723000；3.漢中市農產品質量安全監測檢驗中心，陜西漢中 723000)

茶樹(Camelliasinensis)是重要的經濟作物和飲品之一。茶樹葉片不僅是茶樹供人品飲、經濟產出的對象，也是茶樹進行生理代謝的重要器官，葉片解剖結構與品種遺傳特性和環境聯系密切，直觀體現茶樹對環境的適應和反應[1]。葉片解剖結構鑒定可作為評價茶樹生理活性、抗逆性、生產力和品質等性狀優劣的重要手段，為茶樹品種選育提供理論依據[2]。近年來，有關茶樹葉片解剖結構分析研究在茶樹種質資源評價中得到廣泛應用[3-7]。

陜西南部屬于高緯度的江北茶區，是中國北緣名優綠茶適生區。與南方茶區相比，陜南茶園大多是高山茶園，冬季低溫持續時間較長，較易發生凍害，嚴重時會影響茶園的產量、茶葉品質以及經濟效益[8]。除凍害外，病蟲害、干旱等脅迫也會影響茶樹的產量、茶葉的品質[9-10]。因而陜西栽植茶樹對品種的抗性有更高的要求。陜西漢中種茶歷史悠久，境內保存很多寶貴的茶樹種質資源。漢中茶樹地方品種大體分為西鄉大河群體種、南鄭碑壩群體種、鎮巴紫陽群體種和寧強廣坪群體種[11]。經過長期的自然選擇，本地群體種具有抗性強、內含物豐富的優勢，從中選育優質高抗的本地品種是茶葉科研的重點方向。

已有的研究從表型性狀、生化成分和抗逆性等方面對陜西種質資源進行研究，并取得一定成果，但未從葉片解剖學角度系統評價[12-15 ]。漢中市農業科學研究所保存有400余份陜西茶樹群體種資源。本試驗選取43份來自本地不同群體的優良株系，運用隸屬函數法和與抗寒性相關的線性回歸方程對其葉片解剖結構指標進行分析，初步評價漢中群體種茶樹資源的多樣性與抗逆性，旨在為漢中茶樹本地群體種資源的鑒定評價提供參考，加快本地茶樹良種的選育進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

43個無性系茶樹資源葉片采自位于南鄭區法鎮的茶葉綜合試驗基地(西經 107.06°，北緯 32.89°)，材料信息見表1。

表1 供試材料基本信息Table 1 Information of tested materials

1.2 主要試劑

70%(體積比)乙醇的FAA固定液(每100 mL含福爾馬林5 mL、冰醋酸5 mL、70%乙醇90 mL)、無水乙醇、二甲苯、1%番紅水溶液(番紅染色劑)、0.1%固綠乙醇溶液、石蠟、加拿大樹膠均購自漢中興盛化玻有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 2020年9月初采集樣品，每份無性系材料選擇10株長勢大致相同的植株，從每株樹冠當年生第一輪新梢芽下第4葉位隨機采一片，共10片鮮葉[1,5]。沿葉片中部靠近葉脈兩側剪取約5 mm×10 mm的組織塊，然后置于FAA固定液，10 ℃左右固定3 d后備用。

1.3.2 組織切片制作 采用石蠟切片法制作葉片橫截面組織切片，主要過程包括乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋和徠卡切片機切片，展片和貼片，番紅固綠染片，加拿大中性樹膠封片，制成永久切片保存，以備后續觀察。每份株系制5張切片，每個切片包埋3～5個組織，共215張。

1.3.3 組織切片觀測 將切片置于顯微鏡(Olympus BX53)下觀察并拍照測量。選擇同一株系的數條組織切片中染色清晰結構完整的切片進行觀測。測量葉片的上角質層厚度(thickness of upper epidermis’ cuticle，TUC)和下角質層厚度(thickness of lower epidermis’ cuticle，TLC)、上表皮厚度(thickness of upper epidermis，TU)和下表皮厚度(thickness of lower epidermis，TL)、柵欄組織厚度(thickness of palisade tissue，TP)、海綿組織厚度(thickness of spongy tissue，TS)、葉片總厚度(leaf thickness，LT)、第一層柵欄組織400 μm范圍內細胞個數(the cell amounts in the first layer of palisade tissue in the range of 400 μm，CA)和柵欄組織層數(layers of palisade tissue，LP)9個指標，每份組織條取3個視野觀察拍照，每份材料觀測5個組織條帶，取平均值作為各項指標值。

1.4 數據處理

對觀測的9個指標進行統計，分別計算柵欄組織厚度/海綿組織厚度( P/S)、海綿組織厚度/葉片總厚度(S/L)、上表皮厚度/海綿組織厚度(U/S)、柵欄組織厚度/葉片總厚度(P/L)、海綿組織厚度/柵欄組織厚度(S/P)、抗寒性得分(Y)、生產力指數(N)。采用Shannon-Weave 指數法計算各群體資源的遺傳多樣性指數(H′)。

生產力指數(N)按照公式(1)進行計算[2]；抗寒性得分(Y)按照式(2)進行計算(其中X= P/S)[5]；采用隸屬函數法計算各茶樹株系的抗旱性和抗病蟲性[5]，具體算法見式(3)(其中xi是各項指標量的定值，xmin、xmax是指所有群體葉片解剖結構某一指標的最小值和最大值)，最后計算各株系葉片解剖結構中與抗性有關的指標的平均隸屬函數值，其數值大小與茶樹抗逆性呈正相關。

N=400 μm范圍內第一層柵欄組織細胞 數×柵欄組織厚度

(1)

Y=5.47X-1.78

(2)

F(xi)=(xi-xmin)/(xmax-xmin)

(3)

式中i為1,2,…,43。

以IBM SPSS 23統計軟件進行聚類分析、方差分析、主成分分析，綜合評價各群體的特征。其中，主成分分析中提取特征值大于1.0 的因子作為主成分，計算每個主成分的方差貢獻率和累計貢獻率。以離差平方和Ward’s method進行聚類分析，采用LSD法對聚類群體的解剖指標進一步比較分析。

2 結果與分析

2.1 漢中茶樹資源葉片解剖特征與遺傳多樣性分析

根據切片顯微觀測結果(圖1)和相關指標統計分析(表2)可知，43份資源中HCB10的柵欄組織最薄，P/S最低，導致其生產力指數 (1 653.87)和抗寒性得分最差(-0.02)；HCQ04柵欄組織較厚，其抗寒性得分最高(2.65)。

圖1 部分茶樹資源葉片橫切面Fig.1 Transverse sections of some tea trees

表2 葉片解剖結構指標統計及遺傳多樣性分析Table 2 Basic statistic parameters and diversity indexes of anatomical structure traits of leaves

16項指標的遺傳多樣性指數大于2.0的有5項，其中，U/S遺傳多樣性最大，達到2.15；其次是LT、CA、TS、TL，分別為2.12、2.06、2.02、 2.01。上述結果表明，除了柵欄組織層數以外，漢中茶樹群體資源的葉片解剖結構具有較豐富的遺傳多樣性，遺傳改良潛力較大。

變異系數能反映同一性狀指標在不同茶樹資源間的變異程度。分析43份資源各變異系數位于5.40%～31.78%。其中變異系數最大的是抗寒性得分(31.78%)，其次是S/P(15.12%)和生產力指數(13.83%)，最小的是細胞個數 (5.40%)。變異系數分析結果表明，漢中不同群體茶樹資源的葉片解剖結構出現較明顯的變異。

2.2 漢中茶樹資源聚類分析

43份漢中茶樹資源聚類分析結果顯示，當距離值為5.0時，43份材料聚為4個類群，其中第Ⅰ類群包括9份茶樹資源；第Ⅱ類群包括15份茶樹資源，第Ⅲ類群包括2個亞群，18分茶樹資源；第Ⅳ類群僅有1份茶樹資源(HCB10)(圖2)。

圖2 43份茶樹資源葉片解剖結構性狀聚類圖Fig.2 Clustering map of 43 tea materials based on traits of leaf anatomical structure

2.3 漢中茶樹資源的抗逆性評價

表3展示了與抗逆性相關的7項葉片解剖結構指數及其平均隸屬值，綜合評價不同茶樹資源的抗病蟲性和抗旱性。

2.3.1 抗旱性分析 葉片角質層的蠟質透水性弱，具有防止水分散失的作用，因此角質層厚度和葉片厚度可作為抗旱性的重要鑒定指標之一[16]。采用隸屬函數法計算43份資源的葉片TUC、LUC、TP、LP、P/S、LT和LU 7個指標來評價其抗旱能力。通過表3可知，43份資源的抗旱性平均隸屬函數值位于0.12～0.91，平均值為0.61，表明資源整體抗旱性較強。其中排在前3的群體為：HCQ04>HCX05>HCB07，其抗旱性平均隸屬函數值在0.80及以上，具有較強抗旱性。抗旱性最弱的3個資源為HCB02

表3 43份漢中茶樹資源的隸屬值與抗性分析Table 3 Membership function value and resistance evaluation of 43 tea materials in Hanzhong

2.3.2 抗病蟲性分析 研究表明，TUC、TL、TLC、LT、TP、LP以及P/S與茶樹抗病蟲性密切相關[2,6,9]。利用隸屬函數法計算43份材料這7項指標的抗病蟲性隸屬值，位于0.28～0.87，平均值0.56，表明所選資源整體抗病蟲性較強。其中HCQ04、HCX05和HCB03排在前3位，平均隸屬值均大于0.7，表明該3份資源抗病蟲性優于其他。

2.3.3 抗寒性分析 茶樹抗寒性與葉片解剖結構緊密相關，柵欄組織越厚、細胞層數越多、排列越緊密、P/S值越大，茶樹的抗寒性就越強，因此可以把TP、TU、P/S、CA以及P/L等指標用于鑒定茶樹的抗寒性[2,17]。采用回歸方程(公式2)計算抗寒性得分，得分越高，表明抗寒性越強[10,17]。由表2可知所選資源抗寒性得分在 -0.02～ 2.65，抗寒性最強的是HCQ04(2.65)，抗寒性最差的是HCB10(-0.02)。在43份資源中有41個資源的抗寒性得分大于1.0。

2.4 漢中茶樹資源的適制性分析

根據束際林[2]的研究，茶樹葉片解剖結構指標與其適制性密切相關，柵欄組織越厚，葉綠體含量高，其胡蘿卜素和葉黃素含量越高，適合加工綠茶或烏龍茶。表1表明，有42份資源的柵欄組織厚度大于75 μm，41份資源P/S值大于0.5，上表皮較厚，適制綠茶。此外，HCB10和HCZ02的海綿組織厚度分別達到185.99 μm和183.50 μm，S/P值為2.4和3.11，表明其海綿組織發達，液泡體積大，茶多酚含量高，適制紅茶[2,17]。從葉片解剖角度說明，漢中茶樹資源大部分適制綠茶，少數資源適制紅茶或紅綠兼制。

2.5 漢中茶樹資源生產力水平分析

茶樹有機物的積累依靠光合作用，光合作用越強，茶樹的生產力即產量就越高，柵欄組織是光合作用的主要場所。有研究表明，光合強度與CA和TP相關[1,2,18]。從表2可知，43份資源生產力指數N在1 653.87～3 765.83，平均值達到3 002.28，生產力指數總體較高。其中，有24份資源生產力指數超過3 000，具有高產性狀；有18個資源生產力指數在2 000～3 000，屬于中水平；只有HCB10生產力指數低于2 000，屬于較低水平。生產力指數最高的是HCQ02，生產力指數高達3 765.83。

2.6 漢中茶樹葉片解剖結構指標的主成分分析

對43份茶樹資源的葉片解剖結構指標進行主成分分析，提取特征值大于1的前4個成分，其累計貢獻率達82.91%，包含了16個指標的絕大部分信息(表4)。PC1的貢獻率為46.86%，其中P/L、P/S和抗寒性貢獻最大，TP和LP次之， S/P和S/L的影響為負，主要反映的是茶樹的抗逆性和綠茶適制性相關性狀。PC2的貢獻率為 17.11%，其中LT貢獻最大，TS和TP次之，主要反映生產力和紅茶適制性相關性狀。PC3貢獻率為11.06%，TLC貢獻率最大，TU、U/S和TL次之，主要反映與抗病蟲性相關性狀。PC4的貢獻率為7.88%，CA貢獻率最大，TUC、TL次之。

2.7 漢中茶樹資源的綜合評價

根據43份資源的前4種主成分和相應特征值(表4)，建立線性方程Zi=0.565 17Z(i,1)+ 0.206 33Z(i,2)+0.133 43Z(i,3)+0.095 06Z(i,4)，計算各資源主成分的綜合得分并排序，結果見表5。結合圖1聚類分析和表5排序結果，綜合得分前9位的漢中茶樹資源主要分布在第Ⅰ類群，主要表現為柵欄組織和葉片較厚、生產力指數和抗逆性得分高、S/P值低等特征，表明該類茶樹資源適制綠茶，具有高產潛力，是選育名優綠茶品種的優勢資源。綜合得分后10位的茶樹資源主要分布在第Ⅲ和第Ⅳ類群中，其中第Ⅳ類群的HCB10得分最低，此外其他9個資源中的8個聚集于在第Ⅲ類群的同一亞群，表現為葉片和柵欄組織薄，P/S和P/L值低，S/P和S/L值高，生產力指數低和抗寒性得分低，綜合表現較差。

表4 葉片解剖結構指標主成分分析Table 4 Principal component analysis of anatomical structure traits of leaves

表5 43份漢中茶樹資源的主成分得分Table 5 Score of principal components of 43 tea materias in Hanzhong

3 討 論

陜西茶樹本地群體種資源豐富，已開展的遺傳背景研究、生化成分分析和表型性狀分析等均表明陜西茶樹種質資源遺傳多樣性較豐富[12,19]。本研究從葉片解剖結構性狀的角度分析，16項指標除柵欄組織層數和S/P值外，其他指標遺傳多樣性指數在1.80～2.15，具有比較豐富的遺傳多樣性，進一步證實陜西漢中是茶樹品種改良的資源寶庫。

生產力指數是茶樹資源的重要經濟指標，43份漢中茶樹資源中24份的生產力指數大于 3 000，比例高達55.8%，生產力2 000～3 000的資源占比為41.9%。王飛權等[5]研究發現70份武夷茶樹資源中，14份資源的生產力大于3 000，占比為20.0%；生產力2 000～3 000的資源比例為72.8%。相比較，漢中茶樹群體中具有高產潛力的資源較多。

植物的抗逆性是葉片解剖結構中多項指標綜合作用的結果，難以用單一的解剖結構指標進行評價排序。隸屬函數法將與抗性密切相關的指標結合，系統分析，能夠提高評價的準確性[5,20-23]。本研究從葉片解剖學角度分析漢中茶樹群體種資源抗病蟲性、抗寒性和抗旱性。由于漢中位于中國茶區最北緣，抗寒性是茶樹品種選育的關鍵指標之一。43份漢中茶樹資源中，抗寒性得分最高的前4位中西鄉群體占據3席，該結果與武艷等[24]發現西鄉大河群體茶樹資源抗寒性較強結果一致。

本研究采用主成分分析法，從43份資源中篩選出生產力指數、抗性綜合得分前3的資源HCQ04、HCX05和HCM01，可作為選育高產高抗綠茶品種的對象重點觀測。但茶樹生長的環境條件、栽培方式等因素可能會影響葉片解剖結構的指標，因此下一步研究，還應結合田間調查、加工適制性研究等方式開展鑒定和株系比較試驗，加快選育漢中本地茶樹良種。