野菊抗鹽株系篩選與抗鹽機理初探

薄 杉，夏 斌，劉銘宇，陳 斌，孫 穎，李 強，何 淼

(東北林業大學 園林學院，哈爾濱150040)

土壤鹽堿化是當前全世界面臨的一個非常棘手的問題[1-2]。據統計，世界鹽漬土總面積約10億hm2，中國鹽漬土總面積超過3600萬hm2，占中國可利用土地面積的4.88%[3]。并且，生態破壞的不斷加劇使鹽堿土的面積與日俱增。鹽堿化嚴重的土壤會導致植物代謝紊亂，發生滲透脅迫、離子毒害，使得植物生長不良，甚至死亡，造景效果大打折扣[4-5]，但植物中的高抗鹽類群對鹽堿化土壤有良好的適應性，在鹽堿土上依然有著較好的觀賞效果[6]。所以，改良鹽堿土，促進土壤鹽堿化嚴重地區的園林事業發展，可以通過獲得高抗鹽優異植物類群，并更多地了解其抗鹽機理來實現。

野菊(ChrysanthemumindiumL.),屬于菊科(Compositae)菊屬(DendraothemasGaertn.),為一種多年生草本植物[7]。菊花是中國十大傳統名花之一，觀賞效果好，園林應用價值高[8]。由于野菊源自野外，對各種生境的適應性強于其他菊花品種，且野菊和其他品種的菊花擁有很近的親緣關系[9]。所以，在發掘抗鹽性強的野菊株系的基礎上對野菊的抗鹽性進行研究，對于改善菊花群體的抗鹽性、促進菊花在鹽堿地的應用與推廣、豐富鹽堿地植物種類具有重要意義。但目前，對野菊的研究主要集中在繁育栽培[10]以及食藥用價值[11]方面，對其抗鹽性的研究較少。本研究以引自遼寧省本溪市及周邊區縣的207個野菊株系作為試驗材料進行抗鹽性篩選，以獲得野菊自然群體中的抗鹽株系，并分析其中6個株系在鹽脅迫下的表型、光合生理及滲透調節物質的變化情況，以期初步探明野菊的抗鹽機理，為日后對野菊抗鹽機制的更深入研究及菊花抗鹽新品種的培育奠定理論基礎，使北方地區鹽堿地的園林綠化有著更加豐富的植物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年9-12月在東北林業大學園林苗圃進行，抗鹽株系篩選的試驗材料為引自遼寧省本溪市及周邊區縣的207個野菊株系。

篩選試驗后，從得出的高、中、低抗3大類群中分別選擇2個株系[2個高抗株系：3-25-2(A),4-4-6(B)，2個中抗株系：3-18-3(C)、2-13-2(D)，2個低抗株系：5-11-2(E)、4-7-2(F)]作為抗鹽機理研究的試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的前期準備 選取野菊頂端生長良好且無病蟲害的莖段進行扦插繁殖，扦插基質為珍珠巖，扦插后于溫室中養殖。待扦插苗根長為1～2 cm時，選擇長勢一致的單株進行試驗。

試驗前，用蒸餾水將野菊根部清洗干凈，隨后對其進行適當修剪，使每個野菊單株均保留4～6片真葉。將待測野菊置于塑料箱中水培，水培液是霍格蘭營養液，每2 d更換1次營養液，水培7 d后進行鹽脅迫處理。

1.2.2 鹽脅迫處理 抗鹽株系篩選試驗時，將分析純NaCl固體溶于塑料箱中的霍格蘭營養液中，使得溶液中的NaCl濃度達到且保持在150 mmol/L。每個株系設置15個重復。

抗鹽機理試驗設置1個鹽處理組和1個對照組，處理組的鹽脅迫處理方式同抗鹽株系篩選試驗，對照組繼續用霍格蘭營養液進行培養，每組設置3個重復，每個重復為15株。

1.2.3 野菊抗鹽評價體系的建立與抗鹽株系篩選 野菊抗鹽評價體系的建立：參照劉曉靜等[12]對草坪草質地評價的方法，參照尹冬梅等[13]、宋釗等[14]對植物耐澇性的評價方法，確定對野菊抗鹽性的評價方式：對鹽脅迫后野菊表型的變化情況進行賦分，根據賦分高低對其抗鹽性的強弱進行排名，并結合管志勇等[15]對菊花近緣屬植物抗鹽性評價的研究方法，選擇出現受害癥狀的時間，全株葉片枯萎的時間，鹽脅迫后120 h時的莖色、葉色、葉片枯黃率5個指標對野菊株系的抗鹽性進行評價。通過聚類分析法將此次引種的野菊根據抗鹽性強弱進行分級。

評分方法：鹽處理后，每隔24 h觀察株系的表型變化，統計出現脅迫癥狀的單株以及葉片全部枯萎的單株，根據各個單株出現受害癥狀、葉片全部枯萎發生的時間進行賦分。鹽脅迫處理120 h后，統計各株系每個單株的枯黃率、葉色及莖色并賦分。葉色與莖色均使用NCS比色卡進行比色，其中葉色通過比對自上而下第3片真葉的顏色確定得分。莖色通過比對莖與鹽溶液接觸部位附近的顏色確定得分。葉片枯黃率參照張靜等[16]對竹節草(Chrysopogonaciculatus)耐鹽臨界濃度研究時所采用的目測打分法進行估算，最后根據枯黃率的高低進行賦分。每個指標的評分取平均值。具體評分標準如表1所示。

表1 野菊抗鹽性評價指標與評分標準Table 1 Evaluation index and scoring standard of salt resistance of C.indicum

分數的匯總與分析：評分完成后，將各項指標得分的平均值四舍五入取整數，得出其最終得分。將各指標最終得分相加，獲得各個株系的總分。根據總分的高低對各個株系的抗鹽性進行排名，隨后以總分為依據進行系統聚類分析。

1.2.4 生理指標的測定 抗鹽機理探究試驗進行72 h(保證所有株系均能正常取樣與測量)后，進行相關生理指標的測定。

光合色素含量的測定：選取植株頂部第3～5片功能葉，采用丙酮-乙醇混合液浸提法[17]測量葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類胡蘿卜素的含量，并計算葉綠素a+b(Chl T)、葉綠素a/b的值。

光合指標的測定：使用Li-6400光合儀在晴朗無風的上午9:00-11:30測量凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Cond)，測量時選擇植株自頂部第3～5片功能葉。選用紅藍光源葉室，設置光照度800 μmol/(m2·s)，溫度設置為25 ℃，以大氣CO2作為CO2氣源。每個株系的每個處理測量3個植株，每個植株重復測定3次。計算水分利用效率(WUE =Pn/Tr)、表觀葉肉導度(AMC=Pn/Ci)、氣孔限制值(Ls= 1 -Ci/Ca)。

滲透調節物質含量的測定：選取植株自頂部第3～5片功能葉，采下后用錫箔紙包裹，迅速放入液氮桶中帶回試驗室，置于-80 ℃冰箱，待測。采用蒽酮比色法[17]測定可溶性糖含量，采用酸性茚三酮[16]法測定脯氨酸含量，采用TBA法[17]測定丙二醛含量。

1.3 數據分析

采用Excel 2013對數據進行統計與計算，采用SPSS 22.0進行數據分析，采用R studio進行系統聚類分析。

2 結果與分析

2.1 野菊抗鹽性的評價與分級

對野菊出現脅迫癥狀時間，全株葉片枯萎時間，鹽脅迫后120 h時的莖色、葉色、葉片枯黃率5個指標進行評分。基于所得總分對引種野菊的抗鹽性進行系統聚類分析，結果如圖1所示。通過系統聚類，在距離為10處，根據抗鹽性的高低將本次引種的野菊聚為3類：高抗株系有111個，中抗株系有44個，低抗株系有52個。

圖中各數字字符代表不同的野菊株系

2.2 鹽脅迫對野菊表型的影響

如圖2所示，試驗進行72 h后對照組與處理組的表型之間差別明顯。對照組中各株系均生長良好，莖葉的顏色及形態均未發生明顯變化。處理組各株系的外部形態發生一定變化，高抗株系A、B的葉片變為淺綠色，邊緣發生輕微萎蔫，莖的形態及顏色未發生明顯變化。中抗株系C、D的葉片變為黃綠色，且有一定程度的萎蔫、皺縮，莖色略微變淺，莖的形態無明顯變化。低抗株系E、F的葉片黃化較為嚴重，部分葉片枯萎、脫落，莖色變為淡褐色或褐色，且出現萎蔫現象。

圖2 鹽脅迫下野菊表型的變化Fig.2 Changes of phenotypic in C.indicum under salt stress

2.3 鹽脅迫對野菊光合色素含量的影響

如表2所示，與對照組相比，除株系A的葉綠素a含量外，處理組中各株系光合色素含量均顯著下降(P<0.05)，株系F的下降幅度最大。處理組中，株系D與株系F葉綠素a/b的值較對照組顯著降低(P<0.05)。

表2 鹽脅迫下野菊光合色素的含量Table 2 Photosynthetic pigment content in C.indicum under salt stress

處理組中株系A到株系F的光合色素含量均為下降趨勢，且大部分株系之間存在顯著差異(P<0.05)，葉綠素a/b的值在各株系之間均無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 鹽脅迫對各株系野菊光合特性的影響

如表3所示，對照組的凈光合速率、蒸騰速率均顯著高于處理組(P<0.05)。除株系A、B外，對照組的水分利用效率高于處理組。除株系E、F外，對照組的胞間CO2濃度高于處理組，氣孔限制值低于處理組。對照組的氣孔導度、表觀葉肉導度均高于處理組，株系A的氣孔導度、株系B的表觀葉肉導度與對照組相比差異不顯著 (P>0.05)。

表3 鹽脅迫下各株系野菊的光合指標Table 3 Photosynthetic indexes in C.indicum under salt stress

處理組中，除水分利用效率、表觀葉肉導度外，各株系間的各項光合指標均具顯著性差異 (P<0.05)。株系A到株系F的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、水分利用效率、均呈不斷降低的趨勢，胞間CO2濃度為先降低后升高的趨勢，氣孔限制值、表觀葉肉導度為先升后降的趨勢。

2.5 鹽脅迫對各株系野菊滲透調節相關物質的影響

如表4所示，處理組中各株系的脯氨酸、可溶性糖含量及丙二醛含量均顯著高于對照組(P<0.05)。處理組中株系A到株系F的脯氨酸、可溶性糖含量呈不斷降低趨勢(表4)。丙二醛含量呈不斷上升趨勢。處理組各株系間的脯氨酸含量均存在顯著差異(P<0.05)。除株系A、B外，處理組各株系間的可溶性糖、丙二醛含量存在顯著差異(P<0.05)。

表4 鹽脅迫下野菊滲透調節相關物質含量的變化Table 4 Changes of osmoregulation related substances in C.indicum under salt stress

3 討論與結論

篩選是獲得優良種質，改善植物群體整體質量的基礎[18]。植物抗性的篩選主要基于形態指標與生理指標兩個方面[19]。其中，表型變化是植物受到逆境脅迫最直接的反應，比如莖葉萎蔫、變色等[20]。所以，根據表型可以在短時間內對大量種質資源進行抗性篩選。聚類分析是根據客觀反映研究對象之間遠近關系的統計量(距離或相似性指數)，對研究對象在排除人為主觀因素影響的基礎上進行分類[21]。通過賦分排名及系統聚類分析可知，本研究中207個引種野菊株系的抗鹽性存在一定差異，有111個株系為高抗鹽株系，可能是在不同的生長環境下，土壤的成分與周邊的環境使得野菊在生長發育過程中產生一定的鹽適應性。后期試驗發現，與對照組相比，各株系在鹽處理后表型均產生一定變化，抗鹽性越強的株系表型變化越不顯著。由此可見，抗鹽性強的株系擁有較完備的鹽響應機制，能夠在鹽脅迫下基本保持正常的外部形態，是進行抗鹽性研究的重要材料。

光合色素具有吸收、傳遞光子的功能，是植物光合作用中至關重要的成分，其含量與比例的變化可作為評價植物受脅迫影響程度的重要指標[22]。本研究結果表明，處理組中各株系的光合色素含量較對照組有所降低，且抗鹽性越強的株系降低幅度越小，這與丁丁等[23]的研究結果一致，原因可能是過多的Na+會嚴重影響植物對其他元素的吸收，這些元素有些是光合色素合成所必需的元素，最終使得光合色素的合成受阻[24]。鹽脅迫會導致葉肉細胞受損，使得葉綠素降解酶活性升高，加速葉綠素的分解，從而導致葉綠素含量下降[25]。由于類胡蘿卜素具有消耗過剩光能的作用，但鹽脅迫使得野菊對光能的吸收與轉運受阻，使得類胡蘿卜素發揮的作用很小，所以類胡蘿卜素含量的降低可能會使野菊在受到鹽脅迫時不至于消耗過多的有機物[26]。葉綠素a/b的值在不同處理、不同株系之間的變化相對較小，表明鹽脅迫對于葉綠素a與葉綠素b的影響大致相等，僅在脅迫較重時，鹽脅迫對于葉綠素a的影響大于對葉綠素b的影響。

光合作用是植物進行物質合成與能量代謝的基礎，是植物對于鹽脅迫最為敏感的生理過程之一[27-28]。通過凈光合速率可直接對植物光合作用的情況進行評價[29]。本研究結果表明，處理組的凈光合速率顯著低于對照組，抗鹽性越強的株系下降幅度越小，表明鹽脅迫對野菊的光合代謝過程產生一定的影響，受影響的程度與株系的抗鹽性密切相關，這與王旭明等[25]的研究結果一致。

導致鹽脅迫下植物光合速率下降的原因可分為氣孔因素與非氣孔因素。葛江麗等[30]的研究表明氣孔因素與非氣孔因素之間不是相互獨立的，多重因素的影響會導致二者發生動態變化。氣孔導度、氣孔限制值、胞間CO2濃度是反應氣孔情況的重要指標，其中，氣孔導度與胞間CO2濃度同時下降表明植物光合速率下降主要是由氣孔因素導致的[31]。本研究結果表明，除低抗株系E、F外，其他各株系的氣孔導度與胞間CO2濃度均低于對照組，氣孔限制值高于對照組，表明在脅迫癥狀不重時，氣孔因素是導致野菊光合速率下降的主要因素。表觀葉肉導度可反映RuBPCase活性的高低，是用于評價非氣孔限制程度的指標之一[32]。本研究結果表明，處理組各株系的表觀葉肉導度普遍低于對照組，抗鹽性越強的株系偏低幅度越小，表明隨著脅迫癥狀的加重，非氣孔因素逐漸成為導致野菊光合作用下降的主導因素，這與荊培培等[33]的研究一致。

鹽脅迫下，植物體很容易失去水分。蒸騰速率與水分利用效率是光合作用中與水分關系最為密切的兩個指標，并且水分利用效率是反應植物在鹽脅迫下能量轉化效率的關鍵指標，可在一定程度上反應其抗鹽性的強弱[34]。本研究結果表明，處理組中各株系的蒸騰速率普遍低于對照組，除株系A、B外，處理組中各株系的水分利用效率低于對照組，且抗鹽性越強的株系不汾利用效率和蒸騰速率越高。表明鹽脅迫對野菊的水分代謝機制產生一定的影響，且抗鹽性強的野菊株系在鹽脅迫下有著較高的能量轉化效率,能基本維持水分代謝平衡?？果}性不同的株系蒸騰速率下降的原因有所不同，對于較高抗株系而言，其增大氣孔阻力來減少水分流失導致蒸騰速率略有下降，而對于低抗的株系而言，鹽脅迫導致其膜系統受損嚴重，這種情況下，葉肉細胞的光化學活性嚴重偏低，從而導致CO2的利用效率明顯降低，最終使光合速率與蒸騰速率與對照組或其他株系相比明顯偏低[35]。

滲透調節是植物應對鹽脅迫的重要生理機制之一，對于調節植物水勢的平衡與保持膜系統的完整起著關鍵的作用[36]。有研究表明可溶性糖是非鹽生植物的重要滲透調節物質，也可以作為在脅迫下儲存能量的一種形式[37]。脯氨酸具有清除羥基自由基的作用，保護膜系統免受鹽的毒害，同時維持正常的細胞膨壓[38-39]。本研究結果表明，處理組中各株系的脯氨酸與可溶性含量均明顯高于對照組，表明野菊可通過合成滲透調節物質來應對鹽脅迫帶來的不利影響。處理組中，自株系A到株系F，可溶性糖與脯氨酸含量的下降趨勢為先緩后急，原因可能是抗鹽性較強的株系在該濃度的鹽脅迫下未將滲透調節作為主要的抗鹽機制，滲透調節物質含量依舊存在提升空間，但隨著抗鹽性的不斷減弱，野菊合成滲透調節物質的能力亦在減弱，加之鹽脅迫對其生理代謝活動造成的影響更加不利于其滲透調節物質的合成，形成了惡性循環，導致自株系C到株系F滲透調節物質含量出現了急劇降低的趨勢。株系C的脯氨酸含量顯著大于株系B，說明脯氨酸是野菊在較重鹽脅迫下的主要滲透調節物質，這與李碩[40]等的研究結果一致。丙二醛是膜脂過氧化的產物，其含量可用來衡量植物受脅迫影響嚴重程度的大小[41]。本研究表明，處理組中各株系的丙二醛含量較對照組均顯著升高，且抗鹽性越強株系升高幅度越小，表明鹽脅迫下野菊的膜系統均遭到了不同程度的破壞，但抗鹽性較強的株系的膜系統遭到破壞的程度較小，從而在一定程度上保證生理代謝活動的正常進行。

本研究以150 mmol/L NaCl水培作為脅迫方式，基于表型變化結合聚類分析對207個引種野菊株系進行抗鹽性篩選，并對野菊抗鹽生理機制展開研究。發現引種野菊中有111個株系對鹽脅迫有較強的抗性，抗鹽性較強野菊在鹽脅迫下的水分代謝與合成滲透調節物質的能力較強，從而有效減緩光合色素的分解，保證光合作用不受過大的影響，最終使得表型上發生的變化較小。本研究為菊花抗鹽新品種的選育與抗鹽性更深層次的研究奠定了基礎。