高效液相色譜串聯質譜法同時測定紅曲米中10 種真菌毒素含量

朱偉堃，井改革，趙蕊蕊，畢天琛，趙丹彤，王素香，劉延娟

（山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000）

紅曲米又名赤曲、紅米、福米等，是我國傳統藥食兩用的代表中藥［1］。紅曲米是以蒸至半熟的粳米為原料，接種曲霉科真菌紫色紅曲霉Monascus purpurenusWent. 等菌種，經發酵而成［2］。研究表明，紅曲米發酵過程中會產生莫納可林類（如洛伐他汀等）、甾醇類、紅曲色素等多種代謝產物，這些代謝產物具有預防心血管疾病、抗腫瘤、調脂等藥理活性［3-5］，廣泛應用于醫藥、發酵食品、食品添加劑等領域。紅曲米作為富含淀粉的發酵類谷物，紅曲米的原料、發酵過程、貯存運輸過程等均面臨著被真菌毒素污染的風險。糧谷類［6-7］及淀粉基質的中藥材及其炮制品［8-9］中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏馬毒素、T-2 毒素（T-2）等真菌毒素易超出限量標準。通風干燥的條件下，薏苡仁中黃曲霉毒素B1（AFB1）和黃曲霉毒素B2（AFB2）含量會大幅增加；高溫高濕及通風干燥的條件下，薏苡仁中ZEN含量迅速增加［10］。真菌毒素具有較強致癌、致畸及肝腎毒性［11-12］，有必要建立高效、準確的檢測方法以篩查紅曲米中的真菌毒素，確保食用和藥用安全。目前，對紅曲米中真菌毒素的研究較少，且多集中于桔霉素和赭曲霉毒素等［1，13］。2020 年版《中國藥典（四部）》中列出了真菌毒素單獨或聯合測定的分析方法［8］。但中藥基質復雜，不同基質樣品會導致其分析方法不同［14］。參考《中國藥典（四部）》方法［8］，本研究中采用固相萃取柱凈化，建立了同時測定紅曲米中 AFB1，AFB2，T - 2，DON，ZEN 及黃曲霉毒素 G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、赭曲霉毒素A（OTA）10 種真菌毒素含量的高效液相色譜譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）法，為紅曲米中真菌毒素的檢測提供了參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司），API4000 型電噴霧三重四極桿質譜儀（美國Finnigan 公司）；XS105 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；PRD -S-Q277 型超聲波清洗器（杭州超聲波有限公司，功率為600 W，頻率為42 kHz）；HY - 4型調速多用振蕩器（金壇市江南儀器廠）；3K15 型離心機（德國Sigma 公司）；TTL - DCⅡ型氮吹儀（北京同泰聯科技發展有限公司）；Milli - Q 型超純水儀（美國Merk Millipore公司）。

1.2 試藥

10 種真菌毒素混合對照品溶液（天津阿爾塔科技有限公司，批號為S076583，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，FB1，FB2，T - 2，DON，OTA，ZEN 的質量濃度分別為0.04，0.02，0.04，0.02，0.4，0.4，0.4，10.0，0.04，0.1 μg/ mL，純度為 99.9%，99.3%，99.0%，98.4%，99.0%，98.5%，99.0%，99.9%，99.9%，99.9%）；真菌毒素六合一免疫親和柱（北京華安麥科生物技術有限公司，批號為O0924AZNOTF，規格6 mL，柱容量AFB1，AFB2，AFG1，AFG2 為 300 ng，FB1 和 FB2 為 5 000 ng，T - 2 為 1 000 ng，DON 為 2 000 ng，OTA 為 100 ng，ZEN為1 000 ng）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購于美國Merk 公司；氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、吐溫20、冰醋酸均為分析純，購于天津科密歐化學試劑有限公司；玻璃纖維濾紙（英國Whatman 公司，型號934 - AH，孔徑1.5 μm）；12 批紅曲米及其炮制品（市售，編號1-3 和編號7-9 為紅曲米飲片，編號4-6 為紅曲米藥材，編號10 - 12 為紅曲米炭；編號1 - 6 和編號10-11 產地為福建，編號7-9 產地為安徽，編號12產地為河北），經山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院趙丹彤副主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3 C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A 為 0.01% 甲酸，B 為含 0.1% 甲酸的乙腈 - 甲醇（1∶1，V/V），梯度洗脫（0～2.0 min 時5%B，2.0～2.1 min 時 5%B → 40%B，2.1～7.0 min 時40%B → 55%B，7.0～10.0 min 時 55%B → 90%B，10.0～10.5 min 時 90%B → 5%B，10.5～13.0 min 時5%B）。

2.1.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），多反應監測、正負離子模式掃描；霧化氣：氮氣；霧化氣流速：10.0 L /min；離子源溫度：300 ℃；脫溶劑氣溫度：300 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；碰撞氣：氬氣。質譜采集參數見表1。

表1 10種真菌毒素質譜采集參數Tab.1 Mass spectrometry acquisition parameters of 10 mycotoxins

2.2 溶液制備

樣品前處理：精密稱取樣品粉末6.25 g（過2 號篩），精密加入80%乙腈溶液（含1%乙酸）25 mL，搖床劇烈振蕩（轉速為250 r / min）20 min，離心（轉速為4 000 r/min）5 min，移取上清液；向殘渣中精密加入80%甲醇溶液25 mL，搖床劇烈振蕩（轉速為250 r / min）20 min，離心（轉速為4 000 r/min）5 min，移取上清液，合并2次上清液，混勻，精密量取5 mL，加入35 mL 稀釋液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12H2O 1.16 g），混勻，用玻璃纖維濾紙濾過。精密量取濾液32 mL，緩緩通過已處理好的免疫親和柱，依次用0.1%吐溫20水溶液、水各10 mL 洗脫，待液體排干后，用3 mL 含2%甲酸的甲醇溶液洗脫。洗脫方式為先上樣2 mL，堵住親和柱下方出口，靜置3 min，收集洗脫液；再上樣1 mL，堵住親和柱下方出口，靜置3 min，收集洗脫液。合并2次洗脫液，50 ℃下用氮吹儀吹干。

混合對照品溶液：分別精密量取上述10 種真菌毒素混合對照品溶液 25，50，125，250，500 μL，分別置5 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得混合對照品溶液1-5。

空白基質溶液：經前期測定結果顯示，樣品（編號為8號）未檢出10種真菌毒素，取5份作為空白基質，按樣品前處理方法處理空白樣品，精密量取混合對照品溶液1-5 各2 mL，混勻，用0.22 μm 濾膜濾過，取續濾液，分別為空白基質溶液1-5。

供試品溶液：取樣品，按樣品前處理方法處理，精密加入50%甲醇溶液2 mL，混勻，用0.22 μm 濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取2.2 項下空白基質溶液1-5，按2.1項下檢測條件進樣檢測，典型總離子流圖見圖1，提取離子對色譜圖見圖2。以10 種真菌毒素的峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸。詳見表2。

圖1 10種真菌毒素典型總離子流圖Fig.1 Typical total ion chromatograms of 10 mycotoxins

圖2 10種真菌毒素提取離子對高效液相色譜串聯質譜色譜圖Fig.2 HPLC-MS/MS chromatograms of extracted ion pairs of 10 mycotoxins

檢測限和定量限確定：取2.2項下空白基質溶液逐級稀釋，按3 倍信噪比（S/N）計算檢測限、10 倍S/N計算定量限。結果見表2。

表2 10種真菌毒素線性關系考察與檢測限及定量限確定結果Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ of 10 mycotoxins

加樣回收試驗：精密稱取空白基質適量，分別加入2.2 項下10 種真菌毒素混合對照品溶液0.25，0.625，2.5 mL，制成低、中、高3個濃度的樣品加樣回收試驗溶液，按2.1 項下方法對樣品進行前處理，各平行3 次，結果10 種真菌毒素的平均加樣回收率均在60%～120%之間，相對標準偏差（RSD）均低于6.00%（n= 9），表明方法準確度良好。詳見表3。

表3 10種真菌毒素加樣回收試驗結果（%，n=9）Tab.3 Results of the recovery test of 10 mycotoxins（%，n=9）

重復性試驗：取加樣回收試驗項下中濃度樣品加樣回收試驗溶液，平行制備6 份，按2.1 項下檢測條件進樣檢測。結果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，FB1，FB2，T-2，OTA，DON，ZEN 的平均含量及RSD分別為2.75，1.87，2.87，1.65，33.60，38.92，38.29，3.79，1 007.23，8.83 μg/ kg，RSD分 別 為 4.89%，3.76%，3.20%，3.80%，1.49%，1.95%，1.81%，4.25%，1.53%，1.51%，表明方法重復性良好。

精密度試驗：取2.2 項下空白基質溶液3，按2.1 項下檢測條件連續進樣5 次，結果10 種真菌毒素峰面積的RSD在0.30%～1.97%（n= 5）間，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取加樣回收試驗項下中濃度加樣加收試驗溶液，于室溫下放置0，6，12，18，24 h時按2.1項下檢測條件進樣檢測，記錄10種真菌毒素的峰面積。結果 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，FB1，FB2，T - 2，OTA，DON，ZEN 峰面積的RSD均小于4.0%，分別為2.06%，1.83%，2.98%，1.10%，2.57%，2.06%，1.76%，2.17%，3.00%，2.99%（n= 5），表明待測樣品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4 樣品含量測定

取12 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行2 份，按2.1 項下檢測條件進樣測定，采用空白基質溶液匹配標準曲線，計算10種真菌毒素的含量。結果12批樣品中AFB2，AFG1，FB1，T - 2，DON，OTA 6 種真菌毒素均未檢出，AFB1，AFG2，FB2，ZEN 的檢出情況見表4。

表4 12批樣品中真菌毒素含量測定結果（μg/kg，n=2）Tab.4 Results of the content determination of mycotoxins in the 12 batches of samples（μg/kg，n=2）

3 討論

3.1 色譜與質譜條件優化

2020年版《中國藥典（四部）》中，多種真菌毒素的測定方法均以0.01%甲酸為流動相A，以乙腈-甲醇（1∶1，V/V）為流動相B，梯度洗脫［8］。但該條件下AFG2 的響應值過低，且DON 出峰時間過早，峰形較差。經反復試驗，最終確定以0.01%甲酸為流動相A，以含0.1%甲酸的乙腈 - 甲醇（1∶1，V/V）為流動相B，梯度洗脫，可獲得滿意結果。

按2020年版《中國藥典（四部）》多種真菌毒素的測定方法提供的質譜條件進行檢測，發現OTA 在原負離子模式下響應值過低，不利于檢測，后參考藥典中單獨測定OTA 的質譜條件，正離子模式下OTA 的響應值顯著提高，可獲得較好的檢測結果。

3.2 樣品前處理方法優化

提取液中加入一定量的鹽，并使提取液pH 保持中性或偏酸性，可提取完全真菌毒素［14］。預試驗中，采用原標準中70%甲醇進行提取，發現OTA，DON，ZEN 等的提取效率較低，參考文獻［14-16］和2020年版《中國藥典（四部）》中ZEN 的提取溶劑，采用偏酸性溶液進行提取，可獲得較高回收率。

在通過固相萃取柱凈化時，供試品溶液顏色較深，僅用水無法有效脫去樣品中的色素，影響檢測結果，采用0.1%吐溫20水溶液可顯著提高洗脫效率，并減少色素雜峰的影響。

3.3 基質效應考察

取2.2 項下50%甲醇配制的系列混合對照品溶液和空白基質溶液，分別按2.1 項下檢測條件檢測，并繪制標準曲線。通過比較基質/溶劑2 種標準曲線的斜率比值來判斷某種真菌毒素的基質效應是增強還是減弱。斜率比值大于1 為基質效應增強，斜率比值小于1為基質效應減弱。結果AFG1 和AFG2 的基質效應不明顯，AFB1，ZEN，DON呈基質減弱效應，OTA，AFB2，T-2，FB1，FB2 均呈基質增強效應。可見，超過60%的真菌毒素均受基質效應的影響，故最終確定以空白基質配制標準曲線，以抵消基質效應的影響。

3.4 樣品檢測結果分析

由檢測結果可知，雖有部分樣品檢出，但均符合2020 年版《中國藥典》（一部）中的規定，薏苡仁中AFB1不得過5 μg/kg，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2總量不得過10 μg/kg，ZEN 不得過500 μg/kg［17］，谷物及其制品中ZEN 的限量標準不得過 60 μg/kg［18］，12 批樣品中ZEN的殘留量均符合限量要求。我國尚未制訂伏馬毒素限量標準，參考歐盟標準中對嬰幼兒玉米制品中伏馬毒素的總量（含FB1+FB2）不得過200 μg/kg［19］，12 批樣品均符合要求。

紅曲米及其炮制品受真菌毒素污染的風險較小，但也可能是本研究中收集的樣品量較少、覆蓋范圍較小，今后將擴大樣品收集范圍，進一步深入研究。本研究中建立的方法可同時測定紅曲米中10種真菌毒素，為紅曲米及其炮制品加工、運輸、貯藏過程中的真菌毒素污染風險評估和監測提供技術支持。