大白菜葉脈紫色程度快速及準確劃分方法

王亞秀,張妮南,張學芬,和禹廷,劉小愿,張魯剛

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

花青素不僅可以賦予蔬菜、水果五彩斑斕的顏色，而且還具有豐富的營養價值，同時花青素作為天然的抗氧化劑，也是最強效的自由基清除劑[1]，更有利于預防疾病等功能[2-4]。相較于普通大白菜，紫色大白菜積累了較多的花青素，能夠在不同的生長環境和生長階段表現出不同程度的紫色[5]。在研究中發現，植物組織中是否含有花青素，通常通過肉眼觀察和花青素的測定兩種途徑，肉眼觀察不僅判斷準確性差，而且觀察者也存在差異。花青素的測定方法雖然結果準確，但需要專門儀器，如pH示差法，分光光度計[6]，高效液相色譜串聯質譜儀等方法[7-9]，操作過程復雜，測定成本高，不適宜大量樣品的快速判斷。因此，尋找一種快速檢測植物組織花青素、輔助提高肉眼觀察準確性的鑒定技術十分必要。

對于不同程度紫色大白菜，人眼觀察到的顏色容易受到個體差異和環境因素的影響，色差計可以客觀地定量顏色，并且可以量化評估顏色[10-11]。近年來，色差計在蔬菜和水果品質上評定應用研究日益廣泛[12]，利用色差計可以快速檢測西瓜、番茄紅素含量[13]；測定成熟黃瓜果皮色差值，并根據色差值將黃瓜成熟果皮可分為不同色系[14]；在觀賞辣椒類胡蘿卜素積累特性的研究中，發現色差值a*與類胡蘿卜素具有較高的相關性[15]；有研究報道以色差值L、a、b、c、h和 DA值對冬棗色澤進行判定，發現色澤與甜度存在相關性，說明用色差預測冬棗的甜度是可行的[16]。本研究利用色差計對散葉紫色葉脈大白菜的葉脈顏色判定分析，進一步探討色差計在大白菜葉脈花青素含量判斷中的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的散葉大白菜由西北農林科技大學園藝學院白菜研究課題組提供，種植于西北農林科技大學試驗田。3類材料是經兩代自交的純合系，在蓮座期葉脈表現出明顯紫色、淺紫色和白色表型，群體內單株間性狀表現高度一致。2020-09-01將所有試驗材料播種在72孔穴盤，30 d后移栽到露地，35 d后進行葉脈顏色調查，根據葉脈顏色表型，將散葉大白菜葉脈顏色劃分為紫色(圖1-A)、淺紫色(圖1-B)和白色(圖1-C)，分別用Z、Q和B 表示。

A.紫色葉脈；B.淺紫色葉脈；C.白色葉脈；標尺為 5 cm

1.2 花青素含量測定

移栽到露地35 d后，每個株系選取3個單株，取蓮座期從外往里數第5、6、7片葉脈，距離葉脈底部5 cm處，用刀片切取葉脈上部新鮮樣品將其混勻，取1 g測量花青素含量，將樣品真空冷凍干燥，研磨至均勻的粉末，加入10 mL 1%鹽酸-甲醇溶液，4 ℃低溫避光浸提12 h, 離心后取上清液1 mL，加入pH 4.5的0.2 mol·L-1醋酸鈉緩沖液4 mL，再取上清液1 mL加入pH 1.0 的0.2 mol·L-1氯化鉀緩沖液4 mL，搖勻混合，分別以525 nm和700 nm 為吸收波長測定其吸光度。每個處理重復3次[17]。

提取液花青素濃度(mg·L-1) = A×εL-1×103×MW×稀釋倍數

式中：A = ( A525 nm，pH1.0 -A700 nm，pH1.0 )-( A520 nm，pH4.5 - A700 nm，pH4.5) ；ε為花青苷的摩爾消光系數，26 900；MW為花青苷的摩爾質量(449.2)。

1.3 葉脈色差值測定

用CR-400色差計(北京光學儀器廠) 測定散葉大白菜中不同顏色葉脈的L*、a*、b*值。其中L*代表亮度軸，表示黑白，0為黑，100為白；a*代表紅綠軸，正值為紅，負值為綠，0為中性；b*代表黃藍軸，正值為黃，負值為藍，0為中性。移栽到露地35 d后，每個株系選取3個單株，取蓮座期從外往里數第5、6、7片葉脈，距離葉脈底部5 cm處測定色差值并取平均值，每種顏色分別選擇6個株系進行測量。

2 結果與分析

2.1 不同顏色葉脈的花青素含量比較

采用pH示差法對單位質量不同顏色葉脈花青素含量進行測定，結果如圖2-A所示，紫色葉脈中花青素含量最高，達78.45 mg·kg-1，淺紫色葉脈中含有較高的花青素，含量為16.70 mg·kg-1，而白色葉脈中的花青素含量最低，僅有1.99 mg·kg-1。進一步對不同顏色葉脈花青素提取上清液顏色拍照比較，結果如圖2-B所示，紫色葉脈的上清提取液顏色呈紫紅色，淺紫色葉脈的上清提取液呈粉紅色，白色葉脈的上清提取液顏色則呈黃綠色。總之，不同顏色葉脈花青素的總含量差異達到顯著水平，花青素含量變化趨勢與葉脈顏色由深至淺變化趨勢基本一致，上清液顏色也與葉脈顏色由深至淺變化趨勢基本一致，相比較淺紫色葉脈與白色葉脈花青素含量差異較小，其花青素提取液顏色也比較接近。

A.花青素含量；B.花青素提取液顏色。柱圖上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 不同顏色葉脈的色差值比較

根據葉脈顏色變化將試驗材料劃分為紫色葉脈(Z)、淺紫色葉脈(Q)和白色葉脈(B)。用色差計分別測量其葉脈色差值參數L*、a*和b*，結果表明(圖3)，紫色葉脈(Z)的L*值分布在 47.21～ 53.62，淺紫色葉脈(Q)的L*值分布在 61.63～67.44，白色葉脈(B)L*值在70.62～ 75.31，說明從Z、Q到B葉脈亮度逐漸增加，即反映了從Z、Q到B葉脈的色素積累逐漸減少，反光增強，并且三者的L*值間隔明顯，很容易相互區分。在紅綠軸參數a*中，3類材料也表現出一定的色差規律，Z的參數a*為正值，說明Z的顏色偏向紅色，而Q和B參數a*為負值，說明Q和B的顏色偏向綠色、且Q較B的參數a*值更小，Q和B的a*有明顯間隔，也可以明確區分。黃藍軸b*的表現與紅綠軸參數a*正好相反，Z的b*值為負值，而Q、B的b*值為正值，說明Z比Q和B顏色趨近于藍色，其中Q較B的參數b*小，Q和B的b*存在明顯間隔，可以明確區分。由此可見，3個色差值變化規律與人眼觀察到的顏色變化趨勢基本一致，3種材料的色差值參數L*、a*和b*間均存在明顯差異，但都是Z與Q和B的差異最大，而Q和B的差異較小，區別Q和B需要確定相應的界限值，方可作為一種可靠客觀的表示葉脈顏色變化的方法。

柱圖上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

為了進一步明確區分紫色、淺紫色和白色葉脈顏色差異范圍，對其色差值參數L*、a*和b*值做顯著性差異分析，在0.01水平上分析了3個參數的范圍(表1)。紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈的L*值范圍分別是49.473±2.427、64.530±2.184、72.723±1.652；紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈的a*值范圍分別是11.847±2.396、-2.44±1.593、-6.705±1.611；紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈的b*值范圍分別是-3.315±1.329、 8.765±1.239、13.752±2.445。其中紫色葉脈和淺紫色葉脈、淺紫色葉脈和白色葉脈的L*值邊界的間隔分別是10.446和4.357，淺紫色葉脈和白色葉脈的a*值邊界的間隔分別是1.061，淺紫色葉脈和白色葉脈的b*值邊界的間隔分別是 1.303，可以看出3種材料的色差值參數L*、a*和b*邊界間均存在明顯間隔，其中L*值的間隔最大，最容易區分紫色、淺紫色葉脈和白色葉脈。以上述各個參數間隔的中點作為劃分界，則利用3個參數進行紫色葉脈判斷，其標準如下：色差參數L*值為Z≤52，62≤Q≤68，70≤B；a*值為Z≥9，-3≤Q≤0，B≤-5；b*值為Z≤0，6≤Q≤10，11≤B。因此，可以作為判斷紫色、淺紫色和白色葉脈顏色差異的方法。

表1 不同顏色葉脈色差值平均值差異顯著性分析及有效區間Table 1 Significant analysis of average values and effective interval of different color veins

2.3 色差值與花青素含量的相關性分析

對散葉大白菜不同顏色葉脈總花青素含量與色差值進行相關性分析，結果如表2所示。花青素含量與色差值L*、a*、b*存在極顯著正相關，其相關系數分別為0.8917、0.7979、0.8917，所以色差值在一定程度上可以反應花青素含量。

表2 不同顏色葉脈色差值與花青素含量相關性Table 2 Correlation coefficients among chroma value and anthocyanin content of different color veins

3 討論與結論

前人研究表明富含花青素的蔬菜，不僅抗氧化能力強，對人的大腦、肝臟和腎臟可以產生有效的保護作用[18]，對預防心血管疾病、控制肥胖也有價值[19-20]，因此培育積累花青素的蔬菜成為品質育種的重要方向。通過多年的研究，蔬菜育種科學家已培育出富含花青素大白菜的多種類型[21-24]。本試驗中使用的散葉大白菜是一種新的大白菜材料，其特點是葉脈表型為紫色，富含花青素，是上述紫色大白菜白色葉脈的一個補充，對紫色大白菜新種質創制可以提供新的可能，能夠進一步滿足人們對大白菜多樣性的需求。

由于花青素合成的復雜性及環境條件的影響，普遍存在紫色深淺的判斷情況[25]，紫色觀賞辣椒，因其品種和生長環境不同，對花青素測量標準產生一定影響[26]，茄子果色作為茄子果實的重要商品性狀，選育果皮富含花青素的品種對茄子育種具有一定意義，所以如何快速判斷紫色果色程度顯得尤為重要[27]。而色差計作為一種簡單的顏色偏差測試儀器，通過輸出L*、a*、b*3組數據，從3個方面評估測試材料的色澤變化，從而可以反應相應色素物質含量多少，可以減少因外界因素及人為因素造成的試驗誤差。色差計在番茄、辣椒和茄子等蔬菜上應用廣泛，涉及果皮顏色、番茄紅素含量、類胡蘿卜素含量的測定[28]，但未見在大白菜紫色性狀中的應用。

與其他紫色蔬菜研究類似，本試驗使用的散葉大白菜在紫色葉脈判斷過程中會受多種因素的影響導致肉眼判斷誤差。利用pH示差法，對葉脈花青素提取，不同顏色葉脈花青素提取液在經過12 h處理后出現不同深淺的顏色變化，這與葉脈花青素含量相關；另外，相同顏色葉脈提取液也存在不同程度的顏色梯度，這一結果可能是以肉眼為判斷標準所取的樣品存在差異導致的；值得關注的是Q、B花青素上清液顏色肉眼區分模糊，但花青素測定結果表明Q、B的花青素含量具有顯著性差異，說明可視化結果雖然直觀，但量化的結果更準確，這就要求在取樣過程中更加精細和科學。進一步采用色差計對大白菜紫色葉脈、淺紫色葉脈和白色葉脈色差進行測定比較，結果3個材料3個色差參數的差異均達到顯著水平、并且有不同的間隔，都可以區分3種不同顏色的葉脈，其中3個材料的L*值具有最大的間隔，最容易區分3個材料，相比較花青素測定方法，色差值測定只需要便攜式色差儀，不需要專門試劑和復雜儀器，也沒有樣品前處理等過程，檢測速度快，成本低，是一種簡單、準確的量化紫色性狀的方法，為大白菜紫色葉脈性狀的基因定位、分子機理研究提供了新的方法，解決了采樣過程中因人眼無法準確判斷顏色而導致試驗結果誤差的問題，這與前人利用色差計測定番茄紅素方法相似[13,29]，對于同類研究有一定的借鑒意義。