蘋果樹腐爛病生防鏈霉菌A144的鑒定及其代謝產物的抑菌活性

王 寧，黃 偉，魯致遠，羅 義，馬昊翔，張麗娟，王 瑋

(新疆農業科學院 微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

蘋果樹腐爛病(Apple tree valsa cancer)是由殼囊孢(Valsamalivar.mali)侵染引起的一種真菌性病害，主要造成樹皮、樹干、枝條腐爛，導致樹勢衰弱、蘋果品質和產量下降，嚴重時可致整棵樹枯死[1-2]。目前該病的防治主要通過化學農藥，但長期使用化學農藥不僅會使病原菌產生抗藥性，還會產生環境污染和農藥殘留等問題，對人類健康造成潛在威脅[3-4]。因此，利用生物防治植物病害成為當前的研究熱點，特別是利用微生物防治植物病害越來越受到人們的重視。

放線菌是一類具有重要經濟價值的微生物資源，從微生物中發現的生物活性物質約70%由其所產生，其中約50%來自鏈霉菌[5-6]。利用鏈霉菌產生的次級代謝產物進行植物病害的防治，因其具有高效、低毒無污染、不易使病原菌產生抗藥性等特點，更符合現代農業的綠色可持續發展思路[7-9]。鏈霉菌能產生多種具有生物活性的次級代謝產物，包括脂肽類抗生素、揮發性物質和抗菌蛋白(如細胞壁降解酶：幾丁質酶、蛋白酶和纖維素酶等)[10-11]，在植物病害的生物防治方面具有巨大的應用價值。目前已有較多學者對這方面進行了相關研究，Li等[12]篩選獲得了一株鏈霉菌，經鑒定命名為楊凌糖絲菌，其發酵液對蘋果樹腐爛病菌具有明顯的抑菌作用，抑菌帶寬度達20.2 mm。Prabavathy等[13]從鏈霉菌PMS的代謝產物中分離出脂肽類化合物SPM5C-1，濃度為25 μg/mL時完全抑制稻瘟病和水稻紋枯病的生長。基于此，本研究通過形態學觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析確定菌株A144的分類地位，并研究了菌株A144的發酵濾液、脂肽粗提物、蛋白粗提物以及揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果，旨在為今后蘋果樹腐爛病的生物防治提供菌株資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 菌株A144由新疆農業科學院微生物應用研究所耐輻射微生物資源庫保藏。

植物病原真菌：馬鈴薯黑痣病菌(Rhizoctoniasolani)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、水稻惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、蘋果樹腐爛病菌(Valsamailvar.mail)由中國農業大學李健強教授 贈予。

1.1.2 培養基 高氏一號培養基、PDA培養基、PDB培養基、LB培養基、TSB培養基、MRS肉湯培養基、ISP4培養基均購自海博生物技術有限公司。海生菌肉湯2216E培養基購自美國BD公司。ISP2培養基、ISP3培養基按參考文獻[14]配置，大米浸液Ⅰ、小米浸液Ⅰ和小米浸液Ⅱ培養基按參考文獻[15]配置。

1.1.3 主要試劑與儀器 供試試劑：細菌基因組DNA提取試劑盒，甲醇，鹽酸，硫酸銨，磷酸鹽緩沖劑，0.22 μm微孔濾膜均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

供試儀器：超凈工作臺(浙江孚夏，型號SW-CJ-1F)，氣浴振蕩培養箱(上海天呈，型號TS-2102C)，高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安，型號LDZM-60KGS-Ⅲ)，旋轉蒸發儀(Buchi，型號R-300)，掃描電鏡(日本電子，型號JEM-1230HC)，全自動菌落分析儀(澤析生物，型號ZX-400)，正置熒光數碼顯微鏡(Nikon，型號Ci-L)。

1.2 菌株A144的鑒定

1.2.1 形態學觀察 將斜面保藏的菌株A144接種至ISP4固體培養基上，于30 ℃培養5～7 d觀察菌株生長狀態，挑取菌絲進行革蘭氏染色，記錄菌落顏色形態、氣生菌絲顏色、基內菌絲顏色以及可溶性色素的有無。采用插片法在顯微鏡和掃描電鏡下觀察菌絲、孢子形態。

1.2.2 生理生化特征 參照《鏈霉菌鑒定手冊》[16]和《放線菌快速鑒定和系統分類》[17]中的方法進行生理生化指標的測定。

1.2.3 16S rDNA序列測定 挑取菌株A144的單菌落接種于100 mL/250 mL三角瓶的ISP4液體培養基，30 ℃、160 r/min培養3 d，10 000 r/min離心1 min收集菌絲體，液氮速凍后研磨，用細菌基因組提取試劑盒提取基因組。菌株的16S rDNA序列測定選擇通用引物27F和1492R進行擴增測序，引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ；1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增采用30 μL擴增體系(模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Mix 15 μL，ddH2O 11 μL)，擴增程序：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶經切膠回收后委托北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。測序結果在NCBI數據庫上進行BLAST比對，通過MEGA7.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹，Bootstrap值設為1 000，確定菌株A144的分類地位。

1.3 菌株A144抑菌譜的測定

挑取菌株A144的單菌落接種于50 mL/100 mL三角瓶的2216E液體培養基中，30 ℃、160 r/min震蕩培養3 d作為種子液。將種子液接種于新鮮的2216E液體培養基中，發酵條件為接種量2%、裝液量100 mL/250 mL三角瓶、發酵溫度30 ℃、轉速160 r/min、培養時間14 d，即得到菌株A144的發酵液。將發酵液在4 ℃高速冷凍離心機中，10 000 r/min離心10 min，收集上清，過0.22 μm微孔濾膜得到無菌發酵濾液。

采用含藥平板法[18]檢測無菌發酵濾液的抑菌活性。將無菌發酵濾液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養基以體積比1∶10混合倒板，制成含發酵濾液的PDA平板。在含藥平板中心接種直徑為5 mm的供試真菌菌餅，以不含發酵濾液的平板作為對照，30 ℃培養5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率，所有試驗均設置3個重復。

抑菌率=(對照組病原真菌菌落直徑- 處理組病原真菌菌落直徑)/對照組病原真菌菌落直 徑×100%

1.4 菌株A144代謝產物的抑菌活性

1.4.1 菌株A144不同培養基發酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 將菌株A144的種子液以2%的接種量，接種于不同培養基中， 30 ℃、160 r/min震蕩培養14 d。按照“1.3”中的方法收集無菌發酵濾液并制成含發酵濾液的PDA平板。以蘋果樹腐爛病病原菌為指示菌，將直徑為5 mm的菌餅接種于含藥平板中央，以不含發酵濾液的PDA平板作為對照，每組3個重復，30 ℃培養5 d，測量病原菌菌落直徑，根據 “1.3”中的公式計算抑菌率，篩選菌株A144最佳發酵培養基。

1.4.2 菌株A144脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 按照“1.3”中的方法收集菌株A144的ISP2培養基無菌發酵濾液，采用酸沉淀法提取脂肽，使用6.0 mol/L的鹽酸調節pH至2.0，4 ℃靜置過夜，4 ℃、10 000 r/min離心30 min后收集沉淀，用等體積100%甲醇萃取2～3次，合并萃取液，然后在旋轉蒸發儀中減壓濃縮得到脂肽提取物[19]。用無水甲醇溶解，分別配制成濃度為1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL的脂肽粗提物溶液，并置于4 ℃冰箱保存，備用。

采用平板涂抹法[20]檢測脂肽粗提物的抑菌效果。取100 μL不同濃度的菌株A144脂肽粗提物均勻涂抹于PDA平板上，然后將蘋果樹腐爛病病原菌接種于PDA平板中央，以未涂抹脂肽類粗提物的PDA平板為對照，每組3個重復，30 ℃培養5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑 菌率。

1.4.3 菌株A144蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 按照“1.3”中的方法收集菌株A144的ISP2培養基無菌發酵濾液，在無菌發酵濾液中緩慢加入固體硫酸銨至80%飽和度， 4 ℃靜置過夜，10 000 r/min離心20 min收集蛋白沉淀，用少量滅菌的0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)進行溶解，再置于透析袋(截留分子質量為 7 000 u)放入裝有PBS緩沖液的燒杯中透析除鹽，每8 h換1次PBS緩沖液[21]。將透析得到的蛋白粗提液用無菌的PBS緩沖液分別配制成濃度為50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL的蛋白粗提物溶液，檢測活性方法同“1.5”，對照組為涂抹PBS緩沖液的PDA平板，每組3個重復，30 ℃培養5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.4.4 菌株A144揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 通過平板對扣法[14]檢測菌株A144的揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性。通過劃線法將菌株A144接種于ISP2培養基上，與中央接種蘋果樹腐爛病菌的PDA平板對扣(菌株A144平板在下層板，蘋果樹腐爛病菌的PDA平板在上層板)，用雙層封口膜密封，以未接種A144的平板為對照，每組3個重復， 30 ℃培養5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑 菌率。

1.5 數據處理

采用SPSS 21.0軟件對試驗數據進行鄧肯(Duncan’s)多重比較，結果用“平均值±標準差”表示。采用Graph prism 7.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株A144的鑒定

2.1.1 形態學觀察 菌株A144革蘭氏染色呈陽性，在ISP4固體平板上30 ℃培養7 d后，形成直徑約4～7 mm的圓形菌落，向培養基表面隆起，菌落中央呈灰色，邊緣白色，疏松、多孔，呈同心環；氣生菌絲初為白色，產孢后轉為鼠灰色，表面干燥、粗糙；基內菌絲顏色不恒定，呈灰白色或者淺黃色，無可溶性色素產生(圖1-A)。菌絲生長旺盛，分支較多，大部分呈松散的螺旋狀，部分為勾狀(圖1-B,1-D)；孢子呈卵圓形或橢圓形，鏈狀聚集，表面光滑(圖1-C)。

A.菌落圖；B.菌體圖；C.分生孢子；D.掃描電鏡

2.1.2 生理生化特征 菌株A144生理生化特征結果見表1，耐鹽范圍0～9% NaCl；在pH 5～10內生長；生長溫度為15～55 ℃。菌株A144可以產生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、脲酶、酪氨酸水解酶、苯丙氨酸脫氫酶和甘油脫氫酶活性，未產生接觸酶和硫化氫，無運動性和明膠液化現象，MR試驗、V-P試驗呈陰性，硝酸還原、七葉甘水解、葡萄糖氧化均呈陽性。

表1 菌株A144的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain A144

2.1.3 16S rDNA序列分析 通過PCR擴增菌株A144的16S rDNA，經測序結果分析，其序列大小為1 420 bp，在NCBI數據庫中進行BLAST比對(Genbank序列登錄號：MZ959802)，與StreptomycesrocheiNRRL B-2410達到 99.78%，并與多株鏈霉菌屬菌株相似性在98%以上。選取同源性較高的標準菌株序列構建系統發育樹(圖2)，結合形態學觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析的結果，最終將菌株A144鑒定為婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)。

圖2 基于16S rDNA序列構建菌株A144的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A144 based on 16s rDNA sequence cluster analysis

2.2 菌株A144的抑菌譜測定

由圖3可知，通過將菌株A144的2216E培養基發酵濾液制成含藥平板，對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果最好，抑菌率為68.15%±2.62%，對西瓜枯萎病菌和水稻惡苗病菌的抑菌效果無顯著差異(P>0.05)，抑菌率分別為28.90%±1.79%和33.77%±2.59%，對番茄早疫病菌的抑菌率為 11.43%±0.81%，對馬鈴薯黑痣病菌和西瓜枯萎病菌無抑菌效果。可見，菌株A144的發酵濾液對多種植物病原菌都具有抑菌活性。

圖中相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。“-”表示無抑制效果。A.馬鈴薯黑痣病菌；B.西瓜枯萎病菌；C.水稻惡苗病菌；D.棉花枯萎病菌；E.番茄早疫病菌；F.蘋果樹腐爛病菌

2.3 菌株A144代謝產物的抑菌活性

2.3.1 菌株A144不同培養基發酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖4可知，菌株A144不同培養基的發酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率差異顯著(P<0.05)，表明培養基的成分對菌株A144抑菌物質的產生具有一定的影響。其中ISP4、PDB、MRS培養基發酵濾液對病原菌抑菌效果較弱，抑菌率分別為10.70%±0.15%、 18.73%±2.10%和12.01%±1.62%；而ISP2培養基發酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果最好，抑菌率為85.06%±0.86%。根據抑菌率的大小，菌株A144不同培養基發酵濾液的抑菌效果強弱為：ISP2=小米Ⅱ>ISP3=小米Ⅰ>大米Ⅰ>2216E>TSB>高氏一號=LB>PDB>MRS=ISP4。由表2可知，含小米Ⅱ培養基發酵濾液的PDA平板與含ISP2培養基發酵濾液的PDA平板培養至第5天，病原菌菌落直徑沒有顯著差異 (P>0.05)。但隨著培養時間的延長，培養至第15天時，含小米Ⅱ培養基發酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑達33.62 mm±6.26 mm，含ISP2培養基發酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑達19.38 mm±0.18 mm，兩種培養基的發酵濾液抑菌效果差異顯著(P< 0.05)。綜上所述，選擇ISP2培養基作為菌株A144的最佳發酵培養基。

A.ISP2培養基；B.ISP3培養基；C.ISP4培養基；D.大米浸液Ⅰ培養基；E.小米浸液Ⅰ培養基；F.小米浸液Ⅱ培養基； G.PDB培養基；H.MRS培養基；I.2216E培養基；J.LB培養基； K.TSB培養基；L.高氏一號培養基

表2 菌株A144的ISP2培養基和小米Ⅱ培養基的發酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of ISP2 medium and millet Ⅱmedium fermentation broth of strain A144 on Valsa mali var. mali

2.3.2 菌株A144脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖5可知，菌株A144的脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌具有較好的抑菌活性。由表3可知，50 mg/mL脂肽粗提物的抑菌率比10 mg/mL和1 mg/mL脂肽粗提物的抑菌率分別高出43.61%和61.23%，具有顯著差異(P<0.05)。

A.甲醇對照；B.1 mg/mL脂肽粗提物；C.10 mg/mL脂肽粗提物；D.50 mg/mL脂肽粗提物

表3 菌株A144脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率Table 3 Inhibition rate of crude lipopeptides of strain A144 on Valsa mali var. mali

2.3.3 菌株A144蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖6可知，菌株A144的蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌具有較好的抑菌活性。由表4可知，150 mg/mL蛋白粗提物的抑菌率比100 mg/mL和50 mg/mL蛋白粗提物的抑菌率分別高17.29%和28.24%，具有顯著差異(P<0.05)。

A.緩沖液對照；B.50 mg/mL蛋白粗提物；C.100 mg/mL蛋白粗提物；D.150 mg/mL蛋白粗提物

表4 菌株A144蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率Table 4 Inhibition rate of crude proteins of strain A144 on Valsa mali var. mali

2.3.4 菌株A144揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖7和圖8可知，菌株A144與蘋果樹腐爛病菌進行平板對扣共培養5 d，對照組和試驗組的病原菌菌落直徑存在顯著差異 (P<0.05)，抑菌率為22.87%±4.40%，說明菌株A144產生的揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌具有一定的抑菌活性。

圖7 菌株A144揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果Fig.7 Inhibitory effect of volatile substances of strain A144 on Valsa mali var. mali

A.對照組；B.試驗組

3 討 論

目前，蘋果樹腐爛病的防治主要以化學防治為主，但化學防治存在農藥殘留、病原菌易產生抗藥性及環境污染等問題[22]，生物防治具有高效、低毒無污染以及不易產生抗藥性等優點[8,23]，成為當前的研究熱點。本研究在前期工作中發現鏈霉菌A144對蘋果樹腐爛病菌具有很好的抑菌活性，通過形態學觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析將其鑒定為婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)。婁徹氏鏈霉菌廣泛存在于自然界中，其用來防治植物病害已有相關報道。薛應鈺等[4]從蘋果樹根際土壤中分離出一株婁徹氏鏈霉菌，其發酵液對蘋果樹腐爛病具有較好的抑制效果。李永麗等[24]研究發現，新疆野蘋果內生菌婁徹氏鏈霉菌Am-1發酵液對葡萄座腔菌、蘋果擬莖點霉的抑菌率可達95%以上。發酵培養基的成分不僅會影響微生物的生長繁殖，還會影響微生物活性次級代謝產物的合成速率以及產物的產量和種類[25-26]。本研究中菌株A144的12種不同培養基發酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果具有顯著性差異(P<0.05)，其中使用ISP2培養基培養的菌株A144發酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率最高，達到85.06%±0.86%，高于薛應鈺等[4]和袁雪等[27]分離的鏈霉菌對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果。小米Ⅱ培養基與ISP2培養基的發酵濾液制成的含藥PDA平板培養至第5天時，抑菌效果差異不顯著(P>0.05)，但培養至第15天時含小米Ⅱ培養基發酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑比含ISP2培養基發酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑大14.24 mm，具有顯著性差異(P<0.05)，說明ISP2培養基發酵濾液中的抑菌物質比小米Ⅱ培養基發酵濾液中的抑菌物質的穩定性更好。推測可能的原因一方面是ISP2的培養基更有利于菌株A144抑菌物質的產生和其活性的提高，另一方面是培養時間會影響含藥PDA平板中抑菌物質的穩定性。本研究中ISP2培養基發酵濾液的抑菌率比ISP4培養基發酵濾液的抑菌率高出74.36%，差異極顯著(P<0.01)。ISP4培養基營養成分單一，只有可溶性淀粉作為唯一碳源，(NH4)2SO4作為無機氮源。ISP2培養基成分中葡萄糖作為碳源，酵母提取物和麥芽提取物作為有機氮源。葡萄糖作為速效碳源可直接被微生物利用，可溶性淀粉為遲效碳源，不能被微生物直接利用，需要被分解為單糖才能被利用[28]。有機氮源更利于微生物的生長繁殖和代謝產物的合成[29]。

鏈霉菌在生長代謝過程中會產生多種類型的抑菌活性物質，這些抑菌物質是鏈霉菌表現較高抑菌活性和較廣抑菌譜的重要原因之一[30]。本試驗中菌株A144的脂肽粗提物和蛋白粗提物以及揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌均具有較好的抑制效果，抑菌率分別為81.44%±0.92%、 47.92%±2.55%和22.87%±4.40%。脂肽粗提物是由非核糖體途徑合成的，其主要影響病原菌的細胞膜滲透作用，從而抑制病原菌的生長[26]。Wang等[31]分離出來的楊凌糖絲菌Hhs.01對蘋果樹腐爛病具有抑制作用，從其代謝產物中分離出兩種戊烯大環類脂類物質WH01和WH02。蛋白粗提物是由核糖體途徑合成的，包括一些細胞壁降解酶(幾丁質酶、葡聚糖酶、纖維素酶以及淀粉酶)，植物病原菌的細胞壁主要以纖維素和幾丁質為骨架，以β-1,3-葡聚糖和蛋白質為主要填充物質，故蛋白粗提物的作用機理為降解植物細胞壁，抑制病原菌生長[32-33]。鏈霉菌產生的揮發性氣體種類豐富，包括醇類、醛類、有機酸類、酮類和烯烴類等化合物，主要通過抑制病原菌菌絲的生長以及孢子的萌發[34]。

本研究中鏈霉菌A144的發酵濾液、脂肽粗提物、蛋白粗提物和揮發性物質對蘋果樹腐爛病菌都具有一定的抑菌活性，抑菌率分別為 85.06%±0.86%、81.44%±0.92%、47.92%±2.55%和22.87%±4.40%，表明菌株A144在蘋果樹腐爛病的生物防治中具有良好的開發和應用潛力。