4種梨砧木對梨火疫病的抗病性評價

何臨梓，張校立，葉春秀，陳勵坤,，王永鵬,，田 雯

(1.新疆農業大學 林學與風景園林學院，烏魯木齊 830000； 2.新疆農業科學院 園藝作物研究所，烏魯木齊 830000)

近年來，由梨火疫病菌(又稱為解淀粉歐文氏菌Erwiniaamylovora)引起的梨火疫病已在中國庫爾勒等地被證實[1]。梨火疫病是一種會導致大多數薔薇科植物患病死亡的細菌性病害[2]。植物一旦侵染梨火疫病菌之后，便會迅速地通過組織細胞蔓延到幼嫩的葉片、枝條，形成黑褐色的潰瘍斑，直至枯死。枯死的葉片不落且形成向下的翻卷狀態，遠遠望去如同像大火焚燒過一樣[3]。該病最先開始于200年前的美國哈德遜河谷一帶，由于全球經濟一體化，使得該病害已經傳播于60多個國家和地區[4]。梨屬植物早在3000年前就在中國《詩經》當中就有所記載，且以悠久的歷史豐富多樣的種質資源著稱，現已經成為了世界性的栽培果樹之一[5]。為了防控梨火疫病在中國大面積的流行，不僅要嚴格防控病原菌的進境檢疫，還要了解中國種植的梨種質對于梨火疫病的抗病性水平及機制[6]。

在生產實踐當中，幾乎所有的薔薇科的經濟樹種均是通過嫁接生長的。而在外界環境條件適宜的情況下，嫁接的傷口會明顯增加梨火疫病的危害水平[7]。在易感病的栽培品種上，如果氣候條件和樹體的生理條件適宜，病原菌可以在一個生長季內從一朵感病的花一直向下移動擴散到砧木，從而致使樹木死亡[7]。2000年，學者Thomson研究證實嫁接部位的傷口是梨火疫病菌極易侵染的部位，是該病擴散的一個重要階段[8]。如若接穗與砧木均是高感病的植物，則會使病害迅速蔓延導致枝條枯死，真菌根部受到侵染[9]。如果能結合梨抗性砧木的選育，可以很好地預防梨火疫病的發生和傳播，使抗病性具有更加持久和廣泛的有效性[10]。

目前，對于梨火疫病的研究較為深入，其中很重要的一個防治途徑就是積極尋找到有關抗性突出的梨資源，并大量培育抗性品種以供市場的需求[11]。但關于梨砧木資源對梨火疫病的抗性研究及鑒定的方面的研究鮮有報道。本研究旨在通過結合離體和活體的梨火疫病菌人工接種方式，評價不同梨砧木類型對梨火疫病的抗病性強弱，分析梨砧木資源對于梨火疫病的抗病水平，以期為抗火疫病梨砧木品種選育及梨火疫病的合理防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試種質

供試種質為秋子梨、豆梨、杜梨、川梨(表1)，于巴州農科所資源圃選取生長狀態良好、長勢一致的4種梨砧木類型各5株，采集當年生幼嫩的葉片及枝條(保證葉片健康完整，枝條長短和莖粗基本一致)，放入冰盒中，迅速帶回實驗室4 ℃保存，備用。

表1 抗病鑒定用的梨種質材料Table 1 Pear germplasm materials for identification of disease resistance

1.2 供試菌株

供試菌株Erwiniaamylovora病菌由南京農業大學胡白石教授惠贈。

1.3 細菌菌株培養

參照劉華威等[12]的細菌培養方法。首先將供試菌株接種于營養瓊脂(NA+5%蔗糖)中，用封口膜密封后28 ℃培養箱中培養24 h進行細菌活化，再挑取單菌落利用平板劃線法接于NA培養皿上28 ℃培養，然后將單菌落接入NB培養液中，放置于立式恒溫培養箱中，28 ℃，150 r·min-1培養24 h，選取OD600=1.2左右的菌液作為接種液。

1.4 接種及取樣方法

1.4.1 離體葉片接菌 離體葉片接種方法參照王宏等[13]的離體葉片接菌方法，略有改進。在4種梨砧木上選取長勢一致，大小均勻、完全展開的新生葉片，用無菌水進行沖洗后再用濾紙輕輕地蘸取葉片表面的水分，此過程中避免葉片受損。用微量注射器在距離葉柄基部5 mm處接種梨火疫病菌(統一制造傷口為0.2 cm)，注意接種過程中不要穿透葉柄基部。每種砧木類型接種10片，以無菌水替代菌液，其他條件一致。將接種后的葉片懸放在三角形互為疊放的3根針頭上方(防止葉片被水浸濕，導致葉片褐化)于密封好的培養皿中，培養皿中噴灑少量無菌水，注意不要噴灑于葉片表面。接菌后記錄初始病斑的長度，1～7 d測定病斑長度、病斑長度與嫩梢總長的比例及發病的級別數。根據統計，計算葉片的發病率和病情指數。試驗重復3次。

1.4.2 離體枝條接菌 參照李洪濤等[14]的離體枝條接種方法。截取4種梨砧木1 a生枝條各5根，保證每根長度在25 cm左右，然后帶回實驗室。用無菌水沖洗，下切口斜切后將其插入裝有30%蔗糖溶液中三角瓶中，注意三角瓶中的溶液不超過枝條總長的1/3，然后用微量注射器在第2片完全展開葉處的莖銜接處接種2 μL的菌液(制造傷口統一為0.2 cm)，每種砧木類型接種5根枝條，對照用無菌水代替菌液，重復3次。接種后放置于27 ℃、相對濕度75%及光照3級的恒溫培養箱中進行培養。接菌后記錄枝條長度及病斑總長，1～7 d持續觀察記錄病斑蔓延長度、病斑長度占枝條總長的比例，計算發病率及病情指數。

1.4.3 活體嫩梢接菌 參照“1.4.2”離體枝條接種的方法，略有改進。選取樹齡相同、健康生長和長勢相似的秋子梨、杜梨、豆梨、川梨植株各5株，用無菌牙簽在嫩梢的第2片完全展開葉處與莖銜接處劃一個約0.2 cm的傷口，用微量注射器在傷口中注射2 μL的菌液(注意接種過程中不要穿透嫩梢的莖)，以無菌水替代菌液做對照，重復3次。接種梨火疫病菌后，觀察記錄1～7 d病斑長度、病斑長度與嫩梢總長的比例及發病的級別數。并計算嫩梢的發病率和病情指數。

表2為梨火疫病原菌接種離體葉片和枝條的病情分級標準，均參考李洪濤等[14]的方法并略有改進：

病情指數(DI)= ∑(各級發病枝條數×病級代表值)/(接種總枝條數×最高病級代表值)×100

弱致病力：DI為1～15；中度致病力：DI為 16～35；較強致病力：DI 為 36～69；強致病力：DI≥70。

參考 Kor-ba[15]的抗病性分級指標，制定品種抗病性劃分標準(表3)。

表2 梨火疫病原菌接種離體葉片、枝條的病情分級標準Table 2 Grading standard for disease of isolated branches inoculated with pathogen of pear fire blight

表3 梨火疫病抗病性分級標準Table 3 Classification standard of resistance to pear fire blight

2 結果與分析

2.1 感病特征及抗病性比較

2.1.1 4種梨離體葉片接種梨火疫病的抗性差異 接種梨火疫病菌后，葉片均呈現出不同程度的感病特征(圖1)，較為典型的癥狀為接種點附近及其周邊都呈現出黑褐色色斑。接種后2～3 d后可觀察到接種點周邊微微發黑，4 d后接種點上下的葉脈組織逐漸蔓延開始變黑，部分還流出具有光澤的細菌溢，初期為白色，之后變為琥珀色，粘稠狀。5～7 d葉片病斑變黑壞死。不同梨砧木類型離體葉片的病斑蔓延情況，發病枝條數、測量葉片病斑長度，計算發病率、病情指數，結果見表4。

圖1 離體葉片接種梨火疫病菌的動態變化Fig.1 Dynamic changes of isolated leaves inoculated with pear fire blight

表4 不同梨種質離體葉片接種梨火疫病菌的病斑蔓延情況及接種結果Table 4 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on isolated leaves of different pear germplasm

結果表明，4種梨砧木葉片均對梨火疫病菌侵染有顯著差異(P< 0.05)，平均發病率為 68.6%～88.6%，平均病情指數為27.20～ 62.86。其中秋子梨對梨火疫病菌具有一定的耐病性，屬于耐病(T)；豆梨對梨火疫病菌病情指數為42.238，屬于中感(MS)；杜梨病情指數最高為62.862，屬于感病(S)，川梨也屬于感病(S)。從離體葉片接菌結果來看，秋子梨砧木類型對梨火疫病的抗病性較好，其次是豆梨類型。而杜梨和川梨抗病性表現較差。

2.1.2 4種梨砧木的離體枝條接種梨火疫病的抗性差異 在接種梨火疫病菌后，枝條均呈現出不同的感病特征(圖2)，比較典型的特征就是在接種點附近出現了明顯的色斑。在接種2～3 d后，接種點出現粘稠狀的白色菌膿，會隨著時間大量流出，并且白色菌膿會隨著時間慢慢變成琥珀色。接種4～7 d之后，病情迅速發展，導致接種點上下的植物枝條組織變黑壞死，枝條上葉片也會變黑焦枯，但不會掉落。與病株Erwiniaamylovora的空白對照(無菌水)接種后，接種點及周邊黑斑幾乎無蔓延，無菌膿。不同梨砧木類型離體枝條的病斑蔓延情況、發病枝條數、枝條病斑長度及發病率、病情指數結果見表5。

圖2 離體枝條接種梨火疫病菌的動態變化Fig.2 Dynamic changes of isolated branches inoculated with pear fire blight

表5 不同梨種質離體枝條接種梨火疫病菌的病斑蔓延情況及接種結果Table 5 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on isolated branches of different pear germplasm

結果表明，接種病原菌前后有顯著差異(P< 0.05)，平均病情指數為16.402～33.862。秋子梨對梨火疫病菌屬于耐病(T)，其病情指數為 16.402；豆梨對梨火疫病菌病情指數為18.942，屬于中感(MS)；杜梨和川梨的病情指數分別為 33.862和31.005，屬于感病(S)。根據離體枝條數據分析得出4種梨砧木抗病性大小依次為秋子梨>豆梨>川梨>杜梨。

2.1.3 4種梨砧木的活體嫩梢接種梨火疫病的抗性差異 在接種梨火疫病菌后，嫩梢均呈現出不同的感病特征(圖3)，在接種2～3 d之后，接種點周圍的組織發黑且有少量的蔓延。接種3～4 d之后，發黑有潰瘍斑的部位流出白色菌膿，且發病速度變快。在接種4～5 d之后，發病部位又出現大量的白色菌膿，且有些變成琥珀色，嫩梢的頂端呈現萎蔫狀。在接種5～7 d之后，嫩梢上的病斑可達數十厘米，周邊的葉片萎蔫發黑，但不掉落。與病株Erwiniaamylovora對照的空白(無菌水)接種后，接種點及周邊黑斑幾乎無蔓延，無菌膿。不同梨砧木類型活體嫩梢的病斑蔓延情況、發病枝條數、枝條病斑長度及發病率、病情指數結果見表6。

圖3 活體嫩梢接種梨火疫病菌的動態變化Fig.3 Dynamic changes of isolated branches inoculated with pear fire blight

表6 不同梨種質活體嫩梢接種梨火疫病菌的病斑蔓延情況及接種結果Table 6 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on young shoots of different pear germplasms

結果表明，4種梨砧木枝條均對梨火疫病菌有感病性，且有顯著差異(P< 0.05)。其中秋子梨病斑蔓延速度最緩慢，而杜梨3～4 d病斑蔓延百分比上升20.08%。說明秋子梨對于梨火疫病具有一定的抗病性，而該病原菌對杜梨有著很強的致病力。按照抗性分級可將秋子梨、豆梨、杜梨和川梨分為抗病(R)、耐病(T)、感病(S)和中感(MS)類型。4種梨砧木活體嫩梢類型的抗病性大小依次為秋子梨>豆梨>川梨>杜梨。

2.2 4種梨砧木接種梨火疫病菌相關性分析

由表7～8結果來看，秋子梨、豆梨的離體葉片發病率及病情指數略高于活體接種值，估計有可能是因為室內試驗的接種環境濕度大更有利于梨火疫病菌的生長繁殖所致。且可以看出：離體葉片和離體枝條接種病原菌后得到抗病性分級一致率達到87.5%，對這3種接種方式進行相關性分析，其離體葉片與離體枝條相關系數為0.440，呈極顯著相關性水平(P<0.01)；離體葉片與活體嫩梢相關系數為0.674，呈極顯著相關性水平(P< 0.01)；離體枝條和活體嫩梢接種病原菌后得到抗病性分級一致率達到62.5%，相關性為 0.711，呈極顯著相關性水平(P< 0.01)；說明在人工接種的情況下可以采用這3種方式進行病原菌接種，離體與活體接種方法均可以鑒定梨火疫病抗性，且鑒定結果具有一定的準確性。

表7 不同梨砧木離體葉片、離體枝條接種及活體嫩梢接種抗病性結果Table 7 Disease resistance in vitro leaves,in vitro branches and in vivo young shoots of different pear rootstocks

表8 4種梨砧木離體葉片、離體枝條接種及活體嫩梢相關性分析Table 8 Correlation analysis of inoculation of leaves and branches in vitro and young shoots in vivo of four pear rootstocks

3 討 論

大量的國內外研究表明，如若能培育出抗病品種或篩選出對梨火疫病具有較好的抗性的砧木，就能起到很好地防控病情的作用[12]。2000年，李穎章等[16]對蘋果的組培苗及溫室栽培苗進行火疫病菌接種來研究它們之間的感病性，結果表明易感品種體內的病原菌數量大于較抗品種。2008年，劉華威等[12]對現保存的54份梨種質資源進行抗病性研究，結果表明中國有80.4%的梨資源對梨火疫病具有較好的抗性，東方梨品種比西方梨的抗病性更強。2019年，李洪濤等[14]采用來自國外3種不同的致病菌株對離體枝條和幼果進行抗病性鑒定，結果表明3種菌株均對供試梨種質有較強的致病力，其中2種表現為抗病性，4種耐病性，其他均為感病品種。其中的杜梨屬于高感類型，與本試驗結果一致。國外在抗梨火疫病方面做了不少研究，美國科學家Paprstein等[17]已培育出高抗品種——‘Bohemica’，該品種在供試的14個品種中展現出良好的抗性，并且測試了OHxF 69、87、230和333等砧木類型，結果表明，OHxF-87砧木在梨樹生長和產量方面表現優異。德國學者Reininger 等[18]培育出‘雪蘭多梨’新品種，具有貯藏壽命長、產量穩定、抗火疫病的生理特性。根據本研究結果可知，庫爾勒近年來培育的香梨品種多是嫁接在高感砧木杜梨上，導致庫爾勒地區的特色林果產量急劇下降，嚴重影響地方經濟的發展[19]。所以，在防治梨火疫病方面，還需要繼續篩選出更好的抗病資源用于抗病品種的選育，以在關鍵時刻起到很好地控制病情的作用，確保林果產業的安全生產[20]。

4 結 論

梨火疫病擴散蔓延速度極快，如果一旦流行起來，將會對新疆乃至全國的蘋果、梨等水果產業構成威脅，同時也必將會影響中國其他水果等優勢農產品的進出口貿易。故本試驗采用離體葉片、離體枝條和活體嫩梢結合的方式人工鑒定不同砧木類型對梨火疫病的抗病性強弱，為開展優異梨砧木資源選育及梨火疫病的合理防治奠定理論基礎。2000年，胡白石[21]就進行了花器及幼果接種來進行火疫病抗性鑒定，但他發現花器和幼果抗性閾值比較低，無法將致病力相近的菌株加以區分；并且在花器對火疫病接種鑒定方面沒有形成一定權威性的抗性分級標準，而果實接種病原菌無法很好地量化其發病程度，故本試驗中沒有采用花器及幼果接種方式。

本試驗采用的是離體與活體相結合的方式鑒定其抗病性，方便快捷的同時也能夠很直觀的初步得出抗病性的大小，但有學者認為植物是不存在絕對的抗性，只是對外來病原菌具有不同的反應速度[22]；植物反應取決于生長的階段和環境條件，并且它們的對病原菌的反應速度對表型的表現也有很大的影響；離體葉片、枝條的存活時間有限，可能存在病害沒有完全蔓延，而離體的組織已不能正常地生長的情況；每種梨砧木活體嫩梢之間也存在個體的差異性，也受到日照、濕度、溫度等多方面的影響，可能會造成病情發展的遲緩或加劇[23]。基于上述的情況，后續的試驗中將會在更加封閉隔離的狀態下進行鑒定試驗，確保實驗的準確性。采用更好離體的葉片、枝條的保存方法，讓病情發展更加真實可靠。本研究通過梨火疫病菌人工接種鑒定，分析梨砧木資源對于梨火疫病的抗病水平，以期為梨火疫病的抗病選育提供參考。