姜黃素固體脂質納米粒在大鼠體內的組織分布研究 Δ

李旭，郝迪，王梓，李楠 （天津市醫藥科學研究所，天津 300020）

心腎綜合征（cardiorenal syndrome，CRS）指心臟和腎臟中一個器官對另一個器官的功能損害不能進行代償時，形成惡性循環，最終導致心臟和腎臟功能的共同損害；其發病機制復雜，心腎纖維化是其終末期的主要病理改變，目前尚無特效藥物進行治療[1―3]。姜黃素（curcumin，Cur）可減輕血管緊張素Ⅱ誘導的心肌纖維化和腎間質纖維化[4―5]。本課題組前期研究發現，Cur還可改善CRS模型大鼠的心肌肥大、腎功能以及肺組織損傷[6]。Cur的生物利用度極低（＜1%）且難溶于水（溶解度為0.6 μg/mL），在生理pH下的吸收和穩定性較差，且代謝快、易消除[7―8]，從而限制了其體內研究和臨床應用。

固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）以脂質作為載體材料將藥物包裹在其中，可避免藥物與外界環境接觸，增加藥物的穩定性，延長藥物的半衰期，從而提高藥物的生物利用度[9―11]。本課題組前期采用微乳法制備了Cur-SLN[12]，現采用尾靜脈注射Cur-SLN的方法，觀察Cur在大鼠心、腎、肺和肝組織的分布情況，以期為Cur-SLN治療CRS的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-2010型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司），XW-80A型渦旋混合儀（上海醫科大學儀器廠），HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），XW-80A型定時恒溫磁力攪拌器（上海瀘西分析儀器廠），PHS-3C型精密pH計（上海精密科學儀器有限公司），SZ-100型納米粒度儀（日本Horiba公司），AB135型十萬分之一電子天平、AL204型萬分之一電子分析天平、PL203型精密電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

Cur對照品、大黃素對照品（內標）均購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別為110823-201004、110756-200110，純度均大于98%）；Cur原料藥（批號TZSW200317-1，純度99.0%）購自西安通澤生物科技有限公司；其余試劑均為實驗室常用規格，水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物

本研究所用實驗動物為SPF級SD大鼠，共90只，雄性，體質量220～240 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0006。所用動物均活動正常且毛發柔順，攝食、飲水均正常。本研究獲得天津市醫藥科學研究所倫理委員會批準，倫理審批號為IMPS-EAEP-Z-18JCQNJC13500-01。

2 方法與結果

2.1 Cur-SLN混懸液的制備

參考本課題組前期方法制備Cur-SLN混懸液[12]：稱取處方量的Cur和硬脂酸，于65 ℃熔化，加入2 mL相同溫度的聚山梨酯80-乙醇溶液（質量比1∶4）和8 mL水，渦旋1 min，即得水包油型微乳。在電磁攪拌（1 020 r/min）下，將上述熱微乳以每5 s 1滴的速度滴入2 ℃的分散介質水中，當微乳全部加入后繼續以2 ℃保溫攪拌15 min，即得Cur-SLN混懸液（每毫升Cur-SLN中含Cur原料藥約0.77 mg，載藥量為7.72%，包封率為87.73%）。本研究所制Cur-SLN的理化性質良好，平均粒徑為（168.9±1.0） nm，Zeta電位為－（19.60±0.35） mV，多分散系數為0.212±0.020。

2.2 生物樣品中Cur含量測定方法的建立

采用HPLC法檢測大鼠各組織樣品中Cur的含量。

2.2.1 色譜條件 以DIKMA Diamonsil C18（250 mm×4.6 μm，5 mm）為色譜柱，以乙腈-0.50%磷酸溶液（58∶42，V/V）為流動相；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為426 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）Cur對照品貯備液：精密稱取Cur對照品13.21 mg于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為1.321 mg/mL的Cur對照品貯備液，于4 ℃冰箱中保存。臨用前用甲醇稀釋制成相應質量濃度的標準溶液。（2）大黃素對照品溶液：精密稱取內標大黃素對照品20 mg于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為200 μg/mL的內標溶液，于4 ℃避光保存。

2.2.3 組織樣品的處理 將大鼠的心、肺、腎和肝剪碎后，按照稱定質量的2倍加入生理鹽水勻漿，轉移至離心管中，以4 000 r/min離心10 min，吸取上清液180 μL，精密加入大黃素對照品溶液20 μL、乙酸乙酯-甲醇混合溶劑（體積比為9∶1）1 mL，渦旋3 min后，以12 000 r/min離心10 min；小心吸取上層有機溶劑900 μL轉移至另一離心管中，以氮氣吹干，殘渣加甲醇100 μL復溶，渦旋2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣測定。

2.2.4 專屬性考察 取空白心、肺、腎和肝組織樣品，各空白組織+Cur（0.647 5 μg/mL）樣品以及大鼠給藥后0.5 h的組織樣品各適量，按“2.2.3”項下方法處理（空白組織樣品不需要添加內標）后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，Cur和大黃素的保留時間分別約為10.1、15.0 min，2個色譜峰互不干擾且峰形良好，理論板數以Cur和大黃素計均不低于2 000，且各樣品中的內源性物質不干擾Cur的測定，表明該色譜條件下專屬性良好。結果見圖1～圖3。

圖1 空白組織樣品的HPLC圖

圖2 空白組織+Cur+內標的HPLC圖

圖3 給藥后0.5 h各組織樣品+內標的HPLC圖

2.2.5 線性關系、定量下限、檢測限的考察 取質量濃度為1.321 mg/mL的Cur對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋成質量濃度分別為1 295.00、647.50、323.75、129.50、64.75、12.95、6.475、1.295、0.647 5 μg/mL的系列標準溶液。分別精密吸取心、腎和肝組織的空白勻漿液180 μL，加入上述系列標準溶液20 μL，然后按“2.2.3”項下方法處理，即得Cur質量濃度分別為129.5、64.75、32.375、12.95、6.475、1.295、0.647 5、0.129 5、0.064 75 μg/mL的系列標準心、腎、肝組織樣品溶液。同法精密吸取肺組織空白勻漿液，加入647.50、323.75、129.50、64.75、12.95、6.475、1.295、0.647 5 μg/mL的系列標準溶液，同前處理，得Cur質量濃度分別為64.75、32.375、12.95、6.475、1.295、0.647 5、0.129 5、0.064 75 μg/mL的系列標準肺組織樣品溶液。將上述組織樣品溶液按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以組織樣品中Cur的質量濃度（X）為橫坐標、Cur與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標進行線性回歸，以線性范圍最低值為定量下限，以信噪比3∶1計算檢測限。結果見表1。

表1 不同組織中Cur的線性關系、定量下限、檢測限的考察結果

2.2.6 精密度與準確度試驗 取Cur對照品適量，加入空白組織樣品溶液，按“2.2.3”項下方法制備含Cur定量下限質量濃度的組織樣品溶液以及含Cur低、中、高質量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的組織樣品溶液，每個質量濃度平行制備6份。按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，考察各樣品中Cur質量濃度的日內精密度和準確度；連續3 d進樣，考察批間精密度和準確度。結果顯示，各樣品日內、日間RSD均小于15%（n＝6），準確度均值在標示值的±15%之內，符合生物樣品定量分析的要求[13]。

2.2.7 提取回收率 按“2.2.3”項下方法配制含Cur低、中、高質量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的組織樣品溶液，各6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄Cur峰面積（As）和大黃素（內標）峰面積（Ai）。另取空白組織樣品，同法預處理至氮氣吹干，在殘渣中加入低、中、高質量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的Cur對照品貯備液20 μL，大黃素對照品溶液20 μL、甲醇60 μL，渦旋2 min；以12 000 r/min離心10 min，各質量濃度平行6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄未經提取的Cur峰面積（As’）和大黃素峰面積（Ai’）。分別計算Cur和大黃素的提取回收率：Cur提取回收率（%）＝As/As’×100%；大黃素提取回收率（%）＝Ai/Ai’×100%。結果顯示，低、中、高質量濃度的Cur在心臟組織中的提取回 收 率 分 別 為（89.72±2.13）% 、（92.68±0.74）% 、（97.31±1.45）%，在肺組織中分別為（91.77±1.86）%、（96.27±1.07）%、（98.11±0.37）%，在腎組織中分別為（90.56±2.64）%、（95.19±0.93）%、（97.81±0.11）%，在肝組織中分別為（93.80±3.62）%、（97.77±1.07）%、（95.46±3.47）%，RSD均小于5%（n＝6）；大黃素在心、肺、腎、肝組織中的提取回收率分別為95.21%、94.38%、96.12%、95.72%，RSD均小于4%（n＝6），符合生物樣品定量分析的要求[13]。

2.2.8 穩定性試驗 按“2.2.3”項下方法制備含Cur低、中、高質量濃度（0.129 5、1.295、32.375 μg/mL）的組織樣品溶液，各3份，考察其于25 ℃放置24 h、－40 ℃放置24 h、反復凍融（－40 ℃～室溫）3次的穩定性。結果顯示，各樣品測得質量濃度與理論質量濃度的相對誤差（RE）均在±15%范圍內，提示樣品在上述條件下穩定性良好[13]。

2.3 Cur-SLN在大鼠心、腎、肺、肝組織的分布考察

2.3.1 分組、給藥與樣品采集 將大鼠隨機分為Cur原料藥組和Cur-SLN組，每組45只。于給藥前12 h開始禁食不禁水，參考文獻[14―15]給藥方法，兩組大鼠分別尾靜脈注射Cur原料藥混懸液（以含0.5%聚山梨酯80的生理鹽水溶液溶解，臨用現配）和Cur-SLN混懸液，以Cur計注射劑量為25 mg/kg。分別于給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h時，各組分別取5只大鼠用乙醚麻醉，然后處死，解剖分離大鼠的心、肺、腎和肝組織，用生理鹽水將組織表面的殘血洗凈，定性濾紙吸干后精確稱質量，然后置于離心管內，保存備用。

2.3.2 Cur-SLN給藥后的組織分布 取給藥后不同時間點各組織樣品適量，按“2.2.3”項下方法處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入標準曲線計算不同時間點各組織樣品中Cur的含量。采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析，數據均以±s表示，組間比較采用t檢驗。檢驗水準α＝0.05。結果顯示，與Cur原料藥相應組織樣品組比較，Cur-SLN組大鼠心、腎、肺（0.25～24 h各時間點）和肝（0.25～1 h、12～24 h各時間點）組織樣品中Cur的含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而肝（2～8 h各時間點）組織樣品中Cur的含量則顯著降低（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠給藥不同時間點后各組織樣品中Cur含量的測定結果（±s，n＝5，μg/mL）

表2 各組大鼠給藥不同時間點后各組織樣品中Cur含量的測定結果（±s，n＝5，μg/mL）

a：與Cur原料藥組同時間點同組織樣品比較，P＜0.05；b：與Cur原料藥組同時間點同組織樣品比較，P＜0.01

樣品Cur原料藥組心臟組織Cur原料藥組肺組織Cur原料藥組腎組織Cur原料藥組肝組織Cur-SLN組心臟組織Cur-SLN組肺組織Cur-SLN組腎組織Cur-SLN組肝組織24 h 0.41±0.21 0.23±0.12 1.63±0.35 0.62±0.10 12.57±0.43b 11.24±0.81b 10.92±1.01b 7.82±0.59b 0.25 h 2.67±1.25 0.95±1.34 7.21±2.99 1.82±0.35 7.19±1.18a 13.35±1.13b 18.95±0.31b 25.07±1.17b 0.5 h 6.46±1.87 2.98±1.78 13.32±1.62 8.77±0.40 16.42±1.97b 27.12±1.79b 32.97±1.43b 32.63±0.86b 1 h 13.24±2.51 4.35±1.01 18.09±7.27 42.17±1.17 36.79±0.41b 31.63±0.33b 42.51±2.12b 47.17±1.35b 2 h 16.34±4.11 8.21±0.92 21.75±1.24 75.40±2.21 43.84±0.55b 44.97±0.21b 57.35±3.61b 67.77±1.40b 4 h 12.72±1.44 4.86±1.02 13.35±0.46 120.43±1.92 50.12±3.99b 49.21±0.27b 63.38±1.41b 75.43±0.76b 6 h 7.31±1.23 3.77±0.56 10.13±0.31 63.73±1.40 68.91±0.46 b 56.42±2.30b 80.64±2.49b 52.14±1.57b 8 h 3.92±1.31 2.18±1.59 6.46±1.25 28.87±1.25 21.32±0.68b 22.62±0.39b 25.31±2.23b 23.47±0.93b 12 h 1.09±0.12 0.59±1.20 5.42±1.98 3.48±0.30 16.41±2.11b 17.21±0.61b 16.51±3.17a 10.01±0.73b

3 討論

納米技術的迅速發展為人類很多重大疾病的治療提供了新機會。納米藥物能夠提高難溶性藥物的有效性和安全性，在藥物遞送系統中起著非常重要的作用[16]。Cur具有多種藥理活性，且毒性低、藥源充足，但其生物利用度低，限制了其在臨床中的應用[17]。SLN是一種針對低生物利用度活性成分的理想遞藥系統[18]，能在一定程度上提高藥物的生物利用度。

本課題組前期采用微乳法制備了Cur-SLN，并對其進行了質量評價和體外釋藥研究，其包封率為87.73%、載藥量為7.72%、平均粒徑為（168.9±1.0） nm、多分散系數為0.212±0.02[12]，表明本課題組所制的Cur-SLN粒度均勻，理化性質良好。本研究以Cur原料藥為參照，采用大鼠尾靜脈給藥后，考察Cur-SLN在大鼠心、腎、肺和肝組織中的分布情況。結果發現，與Cur原料藥組比較，Cur-SLN組大鼠心、腎、肺（0.25～24 h各時間點）和肝（0.25～1 h、12～24 h各時間點）組織樣品中Cur的含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而肝（2～8 h各時間點）組織樣品中Cur的含量則顯著降低（P＜0.01）。由此可知，采用SLN負載Cur后，增加了Cur在心、腎、肺組織中的分布，延長了其在心、腎、肺組織中的相對滯留時間，有利于提高Cur在體內的生物利用度。靜脈給藥1 h后，Cur在肝組織中的分布先明顯減少，12 h后又顯著增加，這可能是由于各個組織中的藥物濃度和藥量分布是一個變化的過程，帶負電荷的SLN易在肝組織中蓄積，從而出現肝組織藥物分布的雙峰現象。

綜上所述，本研究將Cur制成SLN后，增加了其在心、腎、肺組織的分布。