相同產地3種龍膽屬植物根及根莖中化學成分的差異分析 Δ

李睿 ，張瑩瑩 ，劉衛紅 ，宋艷秋 ，李龍星 ，李海峰 （1.大理大學藥學院，云南 大理 67100；.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室，云南 大理 67100；.大理大學圖書館，云南 大理 67100；.大理大學公共衛生學院，云南 大理 67100；.大理大學分析測試中心，云南 大理 67100）

龍膽屬植物在全世界約有360種，我國有248種，在全國各地均有分布，且主要集中分布于西南山區[1]。在云南分布的龍膽屬植物有119種及6個變種，其中堅龍膽Gentiana rigescens Franch.被歷版《中國藥典》所收載，是龍膽藥材的基原植物。堅龍膽于1987年就被列入國家重點保護野生藥材物種，并且由于近年來生態環境被破壞（紫莖澤蘭等外來物種入侵）和過度采挖（藥廠需求激增），堅龍膽野生資源急劇減少，瀕臨滅絕[2]。因此，尋找堅龍膽可替代資源具有重要意義。筆者前期通過調研及探訪民間草藥醫生發現，白族民間將堅龍膽G.rigescens Franch.、頭花龍膽 G. cephalantha Franch.和微籽龍膽G. delavayi Franch.這3種主要分布在云南大理的龍膽屬植物統稱為龍膽草，俗稱藍花根、炮仗花、苦草及青魚膽等，以其根及根莖或全草入藥。

據報道，環烯醚萜類、黃酮類化合物是龍膽藥材的主要活性成分[3―5]，其中的環烯醚萜類成分具有保肝利膽（龍膽苦苷）[6]、健脾胃（獐牙菜苦苷）[7]、抗炎殺菌（獐牙菜苷）[8]、調節脂質代謝（苦龍膽酯苷）[9]等功效。本課題組前期采用高效液相色譜（HPLC）法對不同產地頭花龍膽根及根莖中4種環烯醚萜類有效成分（龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷）的含量進行了測定，發現不同產地頭花龍膽中4種環烯醚萜類成分的含量存在差異[10―11]。但考慮到藥用植物的化學成分組成不僅受遺傳因子的影響，還受氣候、土壤等生態環境因子的影響，因此，本課題組以堅龍膽為對照，采用HPLC法對同一產地3種龍膽屬植物（堅龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽）根及根莖中上述4種環烯醚萜類成分進行定量分析，同時借助超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間高分辨質譜聯用（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）技術對上述植物根及根莖中的化學成分進行定性分析，并對質荷比（m/z）在50～2 000之間的化學成分進行主成分分析（principal component analysis，PCA），為從龍膽屬植物中挖掘堅龍膽可替代資源提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Agilent 1200型HPLC儀（美國Agilent公司），Dionex UltiMate 3000型UPLC儀（美國Dionex公司），Compact型質譜系統（德國Bruker Daltonics公司），AE240型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），SK5200H型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

堅龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽樣品均由本課題組于2020年10月采自云南大理，采集地經度為N25°67. 55′、緯度為E99°3. 183′，每個品種隨機采集生長年限大致相同且無病蟲害的開花期植株30株，采集植株之間的株距不小于10 m。采集的植株樣品經大理大學藥學院李海峰教授鑒定為龍膽屬植物堅龍膽G. rigescens Franch.、頭花龍膽G.cephalantha Franch.、微籽龍膽G.delavayi Franch.。將采集的植株樣品根及根莖在40 ℃恒溫箱中干燥至恒質量。龍膽苦苷對照品（批號ZJ0701BA13，純度≥98%）、獐芽菜苦苷對照品（批號M29J4S1，純度≥98%）、獐芽菜苷對照品（批號PN1125SA13，純度≥98%）、苦龍膽酯苷對照品（批號Z06J6S2，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 隨機選取每個品種的根及根莖質量相近的植株10株，混合、粉碎后作為樣品。分別精密稱取粉末0.2 g于10 mL容量瓶中，加入4 mL甲醇，超聲（53 kHz、40 ℃）處理20 min，濾紙過濾，濾渣用4 mL甲醇按上述步驟重復處理1次；合并2次提取濾液至10 mL容量瓶中，冷卻至室溫，加甲醇定容，混勻。使用前用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，收集濾液，即得。

2.1.2 混合對照品溶液 分別精密稱取適量龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷對照品，加甲醇溶解，制備成上述4種成分質量濃度分別為0.200 0、0.050 0、0.005 0、0.005 0 mg/mL的混合溶液，經0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，收集濾液，即得。

2.2 3種龍膽屬植物根及根莖中4種環烯醚萜類成分含量的測定

2.2.1 HPLC檢測條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0～15 min，15%A→35%A；15～40 min，35%A→80%A；40～60 min，80%A→100%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為274 nm（龍膽苦苷）、243 nm（獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及苦龍膽酯苷）；進樣量為5 μL。

2.2.2 方法學考察 按照相關方法進行方法學考察。專屬性考察結果顯示，混合對照品及供試品溶液在相同保留時間處均有相似的色譜峰，并且特征峰與雜質分離良好、無干擾，表明該方法專屬性較好（圖略）。以峰面積（A）對各成分進樣量（x）進行線性回歸，得到龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷的回歸方程分別為 A＝800.04x+40.197（R2＝1.000 0）、A＝1 704.3x－57.269（R2＝0.999 7）、A＝3 014.0x+6.815 4（R2＝0.999 8）、A＝1 763.9x+7.483（R2＝0.999 8），線性范圍分別為1.536～15.36、0.050 50～1.010 00、0.001 63～0.081 60、0.001 57～0.078 40 μg。精密度考察結果顯示，4個成分對照品溶液峰面積的RSD分別為0.44%、1.31%、1.20%、1.25%（n＝6），表明儀器精密度良好。重復性考察結果顯示，供試品溶液中上述4個成分含量的RSD分別為2.32%、2.02%、1.91%、2.78%（n＝6），表明重復性較好。穩定性考察結果顯示，供試品溶液中上述4個成分峰面積的RSD分別為0.42%、0.49%、1.90%、2.94%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內穩定。精密量取適量已知含量的樣品，共9份，分別按已知含量的80%、100%、120%加入龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷對照品（每個濃度3份），并依法測定加樣回收率，結果80%、100%、120%加樣量樣品的平均加樣回收率分別為 100.9%、98.03%、105.3%、97.70%（RSD 分別為2.51%、1.49%、2.33%、1.28%，n＝9），表明該方法準確度良好。

2.2.3 含量測定 取“2.1.1”項下供試品溶液，按“2.2.1”項下HPLC檢測條件測定3種龍膽屬植物中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷的含量，每個樣品均做3組平行實驗。結果顯示，在頭花龍膽和堅龍膽的根及根莖中均檢測到了上述4種成分，但在微籽龍膽根及根莖中未檢測到龍膽苦苷。其中，頭花龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量與堅龍膽根及根莖中含量相近，是2020版《中國藥典》（一部）“堅龍膽”項下限量標準（1.50%）的4.42倍；而在微籽龍膽根及根莖中未檢測到龍膽苦苷，但微籽龍膽根及根莖中獐牙菜苦苷、苦龍膽酯苷的含量分別是堅龍膽根及根莖的34.12、8.81倍，是頭花龍膽根及根莖的9.84、7.45倍。結果見表1。

表1 3種龍膽屬植物根及根莖中4種環烯醚萜類成分的含量比較（±s，n＝3，%%）

表1 3種龍膽屬植物根及根莖中4種環烯醚萜類成分的含量比較（±s，n＝3，%%）

－：未檢出

樣品堅龍膽頭花龍膽微籽龍膽苦龍膽酯苷0.006 0±0.000 1 0.007 1±0.000 2 0.052 9±0.001 2龍膽苦苷7.863 0±0.020 6 6.626 0±0.632 2－獐牙菜苷0.115 5±0.004 3 0.085 8±0.006 8 0.026 9±0.000 7獐牙菜苦苷0.011 1±0.000 6 0.038 5±0.000 5 0.378 7±0.001 8

2.3 3種龍膽屬植物根及根莖的化學成分差異分析

運用UPLC-ESI-Q-TOF-MS法分析3種龍膽屬植物根及根莖的化學成分差異。

2.3.1 色譜及質譜檢測條件 采用Dionex-C18（150 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱，以甲醇（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，15%A→27%A；10～20 min，27%A→35%A；20～40 min，35%A→80%A；40～45 min，80%A→100%A）；檢測波長為 243 nm；柱溫為25 ℃；流速為0.2 mL/min。采用電噴霧離子源（ESI），在正離子模式掃描；毛細管電壓為4 500 V，霧化器壓力為1.8 bar；干燥氣體為氮氣，干燥氣流速為8 L/min；干燥溫度為220 ℃；離子源溫度為220 ℃；掃描范圍為m/z 50～2 000；碰撞氣體為氬氣，掃描時碰撞能量為8 eV；六極桿射頻電壓為70 Vpp，四極桿離子能量為8 eV。準確質量數用甲酸鈉校正液校正。

2.3.2 樣品檢測及數據處理 取“2.1.1”項下供試品溶液和“2.1.2”項下混合對照品溶液，分別按“2.3.1”項下檢測條件進樣測定，分別測得堅龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽3種龍膽屬植物的質譜數據，并將測得的數據用Bruker Compass Data Analysis 4.3軟件進行處理。經課題組前期研究及查閱文獻發現，環烯醚萜類和酮類成分在正離子模式下響應較好[12―14]，因此本研究選擇正離子掃摸模式，選中質譜圖中對應的分子離子峰，即可輸出對應的分子式。結合對照品相關信息、相同類型化合物的裂解規律[15―17]、文獻報道的質譜數據[15―22]進行結構鑒定，并定性分析樣品中的主要活性成分。

2.3.3 結果分析 經分析，從堅龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽根及根莖中共鑒定出33個化合物，包括環烯醚萜類化合物8個（化合物5、6、7、8、16、18、23、27）酮類化合物8個（化合物3、4、10、11、24、28、29、33），黃酮類化合物8個（化合物2、9、12、20、26、30、31、32），生物堿類化合物4個（化合物14、15、17、21），酚酸類化合物3個（化合物1、13、19），三萜類化合物1個（化合物22），苯甲酸酯類化合物1個（化合物25）。3種龍膽屬植物根及根莖中有8個共有成分（化合物1～8），主要為環烯醚萜類化合物；堅龍膽與頭花龍膽根及根莖中有17個共有化合物（化合物1～17），主要為環烯醚萜類和酮類化合物；堅龍膽與微籽龍膽根及根莖中有9個共有化合物（化合物1～8、化合物20），主要為環烯醚萜類化合物。有4個化合物（化合物26～29）僅在堅龍膽根及根莖中鑒定出，為環烯醚萜類和酮類化合物；有5個化合物（化合物21～25）僅在頭花龍膽根及根莖中鑒定出，其中化合物22（三萜類化合物）和化合物25（苯甲酸酯類化合物）為頭花龍膽根及根莖中特有成分；有4個化合物（化合物30～33）僅在微籽龍膽根及根莖中鑒定出，均為黃酮類化合物。3種龍膽屬植物的UPLC-ESI-Q-TOF-MS基峰色譜圖（base peak chromatogram，BPC）見圖1，化學成分鑒定結果如表2。

表2 3種龍膽屬植物的化學成分鑒定結果

圖1 3種龍膽屬植物的BPC

2.4 3種龍膽屬植物根及根莖的PCA

將“2.3.1”下測得的3種龍膽屬植物根及根莖的液質數據導入Bruker Compass ProfilAnalysis 2.2軟件進行PCA，結果見圖2。結果顯示，堅龍膽及頭花龍膽的主成分在空間分布較聚集，差異較小；微籽龍膽與其他2種植物的主成分空間分布較遠，存在較大差異。進一步對3種龍膽屬植物根及根莖的主要差異峰進行分析，結果見圖3。結果顯示，在PCA模式下3種龍膽屬植物中m/z 50～2 000的主成分分布較聚集，但在以下幾個峰存在差異：色譜峰46.52 min、m/z 701.500 0對應點離中心距離最遠，37.52 min、m/z 717.500 0次之，這2個點對差異的貢獻率最大。進一步檢索SDBS及ChemSpider等數據庫對這2個差異峰進行分析發現，這2個差異化合物均為三萜類化合物，且該化合物僅存在于堅龍膽的根及根莖中。其次，32.52 min、m/z 701.500 0，1.52 min、 m/z 543.500 0，46.52 min、m/z 814.500 0，35.52 min、m/z 814.500 0，45.52 min、m/z 814.500 0，34.52 min、m/z 814.500 0，34.52 min、m/z 701.500 0，1.52 min、m/z 229.500 0等10個點和中心也有一定距離，差異也較大。進一步檢索上述數據庫，發現這些差異化合物主要為脂肪族化合物和氨基酸。

圖2 3種龍膽屬植物根及根莖的PCA結果

圖3 3種龍膽屬植物根及根莖主要差異峰分析

3 討論

3.1 4種定量分析指標的選擇

有許多含有龍膽藥材的傳統中藥方劑都有很好的治療肝膽脾胃的作用，如出自宋代《太平惠民和劑局方》的中藥制劑龍膽瀉肝湯等。龍膽屬植物主要藥效成分為環烯醚萜類化合物，其中以龍膽苦苷為代表，其是龍膽藥材的質量控制指標性成分。此外，獐牙菜苦苷作為日本當藥的主要活性成分，具有很好的健胃功效[7]；Wang等[8]研究發現，在治療類風濕性關節炎的藏藥翼首草中起抗炎作用的主要活性成分可能是獐牙菜苷；Potunuru等[9]研究發現，口服苦龍膽酯苷可以減弱糖尿病介導的新生內膜增厚以及脂質在主動脈內膜的沉積，從而降低動脈粥樣硬化的發生風險。因此，本研究采用HPLC法測定了上述4種環烯醚萜類成分含量。

3.2 頭花龍膽和堅龍膽中化學成分的差異分析

經HPLC分析，在堅龍膽、頭花龍膽中均可檢測到上述4種成分，且龍膽苦苷含量均達到2020年版《中國藥典》（一部）“堅龍膽”項下標準含量限度的4倍以上，這提示頭花龍膽具有替代堅龍膽的可能性。通過UPLC-ESIQ-TOF-MS技術從堅龍膽和頭花龍膽根及根莖中共鑒定出17個共有化合物，主要為酮類和環烯醚萜類成分。另外，苯甲酸酯類化合物苯甲酸酯B和三萜類化合物3β-Urs-12-en-3-yl palmitate為頭花龍膽所特有。近年來，相關研究發現，苯甲酸酯類化合物對阿爾茨海默病有治療作用[23]。經PCA發現，頭花龍膽和堅龍膽的主成分空間分布聚集在一起，表明頭花龍膽和堅龍膽的根及根莖主成分差異較小，這進一步驗證了頭花龍膽的可替代性。

3.3 微籽龍膽與堅龍膽根及根莖中化學成分的差異分析

經HPLC分析，微籽龍膽中未檢測到龍膽苦苷，但可以檢測到獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷3種成分，其中獐牙菜苷、苦龍膽酯苷的含量高于堅龍膽。通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS技術定性分析，在微籽龍膽根及根莖中鑒定出15個化合物，其中有9個化合物也同時在堅龍膽中被鑒定出，這9個共有化合物主要為環烯醚萜類成分，并且龍膽藥材的主要活性成分龍膽苦苷也在微籽龍膽中被檢測出。此外，有4種化合物僅在微籽龍膽根中被鑒定出，主要為黃酮類成分，分別是葛根素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、hypolaetin-8-O-β-D-glucoside和酮（3個羥基，2個甲氧基）。黃酮類成分具有較好的抗炎、抗氧化活性[16]，由此推測微籽龍膽可能比堅龍膽具有更好的健胃抗炎等藥理作用。經PCA發現，微籽龍膽根及根莖的主成分空間分布與堅龍膽分布在不同區域，距離較遠，表明微籽龍膽與堅龍膽主成分差異較大。這與含量分析結果相符，進一步證明了微籽龍膽與堅龍膽的根及根莖存在差異。

綜上所述，同一產地堅龍膽與頭花龍膽根及根莖中4種主要活性成分含量差異較小，但微籽龍膽與堅龍膽根及根莖的4種主要活性成分含量差異較大。三者化學成分組成也存在差異，堅龍膽和頭花龍膽根及根莖中主要為環烯醚萜類和酮類成分，而微籽龍膽根及根莖中主要含有環烯醚萜類和黃酮類成分。因此，微籽龍膽不能代替堅龍膽入藥。而頭花龍膽與堅龍膽的根及根莖中化學成分差異較小，替代后者入藥的可能性較大，但仍需通過藥理實驗加以驗證。