五味子治療過敏性哮喘的藥效物質基礎研究 Δ

邴一凡，張天雷，孫志偉，楊小龍，李蘇楠，姜雪，曲中原 （哈爾濱商業大學藥學院，哈爾濱 150076）

過敏性哮喘是一種機體受到外界抗原性或非抗原性刺激產生的氣道高反應性呼吸道疾病。目前我國成年人的哮喘發病率約為1.09%，兒童的患病率也在3.02%左右[1]，這已然成為當下我國面臨的重大公共衛生問題。過敏體質人群常因受到外界環境如過敏原（花粉、植物和塵螨）、食物、藥物、空氣污染等因素的刺激，引發氣道高反應和氣道炎癥，出現反復的呼吸困難、喘息、胸悶和咳嗽等癥狀[2]。西醫多通過使用抗炎或支氣管擴張藥物來達到緩解病情的目的[3]，但臨床常用的皮質類固醇等激素類藥物容易使人體產生耐藥性，且長期使用會導致機體代謝紊亂。因此，越來越多的患者選擇中醫辨證論治或中西醫結合進行治療。

中醫將過敏性哮喘定義為“哮病”，分為熱哮、寒哮等，其中寒哮的特征與西醫的過敏性哮喘比較接近。因此，從治療寒哮的溫肺散寒、化痰定喘類中藥中尋找防治過敏性哮喘的有效藥物已成為研究熱點[4]。五味子為木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[5]。在醫圣張仲景的射干麻黃湯、小青龍湯以及臨床經驗方加味過敏煎、哮喘方等治療過敏性哮喘的經典名方中，五味子均發揮了斂肺、止咳、平喘之功[6―7]。臨床亦有用五味子單方治療經期哮喘的案例[8]。研究表明，五味子中含有木脂素、黃酮、有機酸、揮發油等化學成分[9]；五味子水煎液、五味子木脂素和揮發油均可通過抑制輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）相關炎癥因子、緩解肺部炎癥浸潤來改善哮喘癥狀[10―11]。上述研究提示，五味子治療哮喘的效果可觀，且應用前景理想，但其潛在的藥效物質基礎還不十分明確。

五味子在臨床常與其他中藥配伍后以水煎液的形式應用于治療過敏性哮喘。因此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術分析不同批次五味子水煎液中的共有成分，并采用灰色關聯度和Pearson相關性分析法探討其共有峰與治療過敏性哮喘之間的關系，篩選活性成分，旨在初步闡明五味子治療過敏性哮喘的潛在藥效物質基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有ACQUITY型UPLC儀（美國Waters公司）、液相色譜-G6500系列四極桿-飛行時間質譜聯用儀（美國Agilent公司）、BSA型萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）、iMark型酶標儀（上海伯樂生命醫藥產品有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

10批五味子藥材分別購自各地藥材市場或自采，經哈爾濱商業大學藥學院曲中原教授鑒定均為木蘭科植物五味子S. chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實，藥材具體來源信息見表1。五味子醇甲對照品（批號MUST-18031905）、戈米辛 J對照品（批號 MUST-18041102）和戈米辛M2對照品（批號MUST-18010412）均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%；五味子醇乙對照品（批號AM407S）、五味子甲素對照品（批號AM268S）、五味子乙素對照品（批號AB266S）和五味子丙素對照品（批號AM509W）均購自天津一方科技有限公司，純度均大于98%；卵白蛋白（ovalbumin，OVA；批號9006-59-1）購自北京博奧生物集團有限公司；百令膠囊（批號18010016，規格每粒0.5 g）購自杭州中美華東制藥有限公司；γ干擾素（interferonγ，IFN-γ）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）酶聯免疫吸附檢測試劑盒（批號分別為elisa3578、elisa1033、elisa2444）均購自上海廣銳生物科技有限公司；色譜級甲醇、乙腈購自德國Merck KGaA公司，色譜級甲酸購自美國Fisher公司，其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

表1 五味子藥材樣品的來源信息

1.3 動物

本研究所用動物為健康SPF級雄性SD大鼠，共104只，體質量為170～190 g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，實驗動物生產合格證號為SCXK（吉）-2018-0007。飼養室空氣狀況良好，溫度適宜，相對濕度為40%～70%，12 h/12 h光照晝夜循環。實驗前連續適應性飼養7 d，實驗過程中食物和水充足。動物實驗經哈爾濱商業大學藥學院動物倫理委員會批準后實施（批準號為201803009）。

2 方法

2.1 不同批次五味子水煎液的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.1.1 供試品溶液的制備 分別取10批五味子供試品粉末各1 g，按料液比1∶10（g/mL，下同）加水回流提取1 h，過濾后濾渣再按1∶8的料液比加水回流提取1 h，過濾后合并2次濾液，置于水浴鍋上濃縮成浸膏（得率為13.5%～14.3%）。取全部浸膏，加適量乙腈定容于10 mL容量瓶中，制成質量濃度為0.1 g/mL（按生藥量計）的五味子供試品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液，并記為SG1～SG10，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛J、戈米辛M2對照品各3.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加乙腈超聲（功率200 W，頻率40 kHz）5 min溶解，待冷卻后，用乙腈定容，得到各對照品質量濃度均為0.3 mg/mL的單一對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，23%B；3～7 min，23%B→40%B；7～8 min，40%B→42%B；8～11 min，42%B→55%B；11～13 min，55%B→65%B；13～14 min，65%B→75%B；14～19 min，75%B→100%B；19～23 min，100%B→23%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL；檢測波長為216 nm。

2.1.4 質譜條件 離子化模式為電噴霧正離子模式；離子源電壓為5 500 V；離子源溫度為550 ℃；裂解電壓為80 V，碰撞能量為35 eV；氣簾氣壓力為35.0 psi；離子源氣體1壓力為55.0 psi，離子源氣體2壓力為5.0 psi；一級質譜母離子掃描范圍為質荷比（m/z）80～1 500；信息依賴式采集（information-dependent acqusition，IDA）設置響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為m/z 50～1 500。

2.1.5 化學成分解析 在CNKI、PubChem、ChemSpider等數據庫中查詢五味子中化學成分的名稱、分子式、相對分子質量、結構式等信息，建立五味子成分數據庫。將UPLC-Q-TOF-MS/MS分析中化學成分的一級離子峰、二級碎片離子及保留時間等信息與所建立的數據庫進行比對，同時結合對照品數據信息和文獻資料對化學成分進行鑒定。

2.2 不同批次五味子水煎液治療過敏性哮喘的藥效比較研究

2.2.1 試藥的制備 取10批五味子樣品，分別按“2.1.1”項下方法制備浸膏。取適量浸膏加水溶解，制成質量濃度為0.9 g/mL（按生藥量計）的灌胃溶液，并記為C1～C10。

2.2.2 大鼠過敏性哮喘模型的建立及給藥 取SD大鼠按體質量分層隨機分為空白組、模型組、陽性對照藥（百令膠囊）組和10批樣品給藥組，分別編號為A1～A13組，每組8只。除A1組外，其余各組大鼠均參照文獻[12－13]方法造模：分別于實驗第1、8、14天腹腔注射新鮮配制的生理鹽水混懸液[含OVA 60 mg（5%）和氫氧化鋁凝膠100 mg（10%）]，每次每只大鼠注射1 mL。并從實驗第15天起連續16 d將大鼠放入自制霧化箱中，吸入含1%OVA的生理鹽水進行霧化激發（20 min）。A1組以生理鹽水代替混懸液進行腹腔注射和霧化激發。于實驗第15天起，在霧化激發前，A1～A2組大鼠灌胃給予生理鹽水，A3組大鼠灌胃給予百令膠囊0.92 g/kg[本研究按成人（體質量60 kg）百令膠囊的臨床用藥最大劑量9 g，換算成大鼠等效劑量約為0.92 g/kg]；A4～A13組大鼠分別灌胃給予10批五味子水煎液1.23 g/kg（以生藥量計），劑量依據前期預實驗結果設置。

2.2.3 大鼠一般行為學觀察 末次霧化1 h后，觀察各組大鼠的皮毛光澤度、精神狀態以及是否有呼吸急促、搔鼻、打噴嚏等現象。

2.2.4 血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量測定 末次霧化1 h后，大鼠摘眼球取血（每只大約取5～8 mL），分別放于EP管中，在室溫條件下靜置30 min，然后以3 000 r/min離心15 min。用移液槍小心吸取上層血清，按試劑盒說明書分別測定血清中IFN-γ、IL-4和IgE的含量。

2.3 不同批次五味子共有成分與血清藥效指標的相關性分析

2.3.2 Pearson相關性分析 將各共有峰的峰面積定義為X，IFN-γ、IL-4和IgE的含量定義為Y，采用SPSS 25.0軟件對X和Y進行Pearson相關性分析。

2.4 統計學方法

采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行統計分析。實驗結果以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 不同批次五味子水煎液的UPLC-Q-TOF-MS/MS化學成分鑒定結果

在正離子模式下采集五味子不同批次樣品的質譜信息，分別提取其基峰離子色譜圖（base peak chromato‐gram，BPC）并進行疊加，BPC疊加圖見圖1。通過與相關文獻和對照品比對，最終在10批樣品間共確定21個共有峰（依次記為F1～F21），主要為木脂素類、有機酸類和倍半萜類化合物（表2）。

表2 10批五味子水煎液的共有成分

圖1 10批五味子樣品的BPC疊加圖和共有峰

3.2 不同批次五味子水煎液治療過敏性哮喘的藥效考察結果

3.2.1 一般行為學觀察結果 在實驗第1～14天腹腔注射OVA致敏期間，各組大鼠均沒有出現明顯癥狀；于實驗第15天霧化激發開始后，與A1組比較，A2組大鼠逐漸出現呼吸急促、咳嗽、打噴嚏等現象，同時伴有皮毛無光澤、身體消瘦、精神不振、蜷臥等癥狀。給藥前，A3～A13組大鼠的一般情況與A2組大鼠無明顯差別；給藥16 d后，A3～A13組大鼠皮毛顏色光亮，呼吸急促、咳嗽、打噴嚏和蜷縮等癥狀減輕，整體狀態得到改善。

3.2.2 血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量測定結果 與A1組比較，A2組大鼠血清中IFN-γ含量顯著降低（P＜0.01），IL-4、IgE含量均顯著升高（P＜0.01）。與A2組比較，A3～A13組大鼠血清中IFN-γ含量均顯著升高（P＜0.01），IL-4、IgE含量均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 各組大鼠血清中IFN-γ、IL-4和IgE含量測定結果（±s，n＝8）

3.3 不同批次五味子共有成分與血清藥效指標的相關性分析結果

灰色關聯度分析結果顯示，有11個峰與IFN-γ、IL-4和IgE關聯度的平均值（rˉ）＞0.8，這11個共有峰的平均關聯度大小為峰18＞峰9＞峰3＞峰7＞峰5＞峰4＞峰12＞峰6＞峰19＞峰17＞峰20。Pearson相關性分析結果顯示，峰3～7、9、19、20與IFN-γ的含量呈顯著正相關（P＜0.05），峰3～7、9、18～20與IL-4的含量呈顯著負相關（P＜0.05），峰3、4、6、7、9、18～20與IgE的含量呈顯著負相關（P＜0.05），該結果提示潛在的活性成分為峰3、4、6、7、9、19、20代表的成分。將上述2種分析結果取交集，最終篩選出峰3、4、6、7、9、19、20代表的成分可能為五味子治療過敏性哮喘的潛在藥效物質（圖3）。

圖3 五味子各共有峰與藥效指標灰色關聯度和Pearson相關性分析結果

4 討論

過敏性哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病。在變應原誘導的哮喘中，IgE介導、T細胞依賴的炎癥反應機制起了主要作用。近年來，有學者提出哮喘發作與Th1/Th2類細胞因子比例失衡相關。哮喘發作時患者體內Th1細胞亞群百分比降低，Th2細胞亞群百分比升高，導致Th1細胞分泌的細胞因子（如IFN-γ）的表達量降低，Th2細胞分泌的細胞因子（如IL-4）的表達量升高。Th1/Th2比例失衡，致使Th2細胞過度分化，這將會誘導B細胞合成IgE，同時抑制T細胞向Th1分化，進而加劇Th1/Th2比例失衡[20―21]。因此，本研究選擇 IFN-γ、IL-4和IgE含量作為指標來進行治療過敏性哮喘的藥效學評價。在本研究中，A2組大鼠出現呼吸急促、咳嗽、精神不振等哮喘相關癥狀，同時血清中IFN-γ含量顯著低于A1組，IL-4和IgE含量均顯著高于A1組。然而相比于A2組，A3～A13組大鼠喘咳等癥狀明顯減輕，血清中IFN-γ含量均顯著升高，IL-4和IgE含量均顯著降低（P＜0.01）。結果表明，10批不同產地五味子均能夠改善過敏性哮喘模型大鼠Th1/Th2比例的失衡，進而抑制IgE生成，減輕呼吸道炎癥反應。

本研究結合灰色關聯度和Pearson相關性分析結果，推測出五味子醇甲、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛M2、戈米辛J、前戈米辛和當歸酰戈米辛H這7種成分可能為五味子治療過敏性哮喘的有效成分。通過查閱文獻，筆者發現五味子醇甲有舒緩氣道平滑肌的作用[22]，且可能通過阻斷鈣離子通道發揮作用[22]。五味子乙素可通過減少嗜酸性粒細胞，抑制氧化應激，改善肺部炎癥因子表達，改善哮喘癥狀[23]。呂希等[24]通過網絡藥理學研究篩選出五味子丙素為五味子中治療哮喘的靶標成分，這與本研究結果相互印證。本研究結果為進一步探究這7種成分治療過敏性哮喘的藥效和機制提供了數據支持和理論支撐。

綜上，本研究運用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析得到10批五味子水煎液之間的21個共有成分，并結合藥效學實驗，采用相關性分析方法篩選出五味子醇甲、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛M2、戈米辛J、前戈米辛和當歸酰戈米辛H可能為五味子治療過敏性哮喘的藥效物質。但此結果僅根據藥效指標與共有峰峰面積數據進行簡單統計學分析后得出的，具有一定的片面性和不確定性，有待于進一步建立動物哮喘模型進行驗證。

（利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突）