蒙花苷體內外抗肺纖維化作用及其機制研究 Δ

黃梨婷，王珠強，王依婷，范衛鋒，董更婷，彭偉文（廣州中醫藥大學附屬中山中醫院藥學部，廣東 中山 528400）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種進行性、致命性的疾病，主要表現為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積、肺間質纖維瘢痕化和肺部重塑[1]。近年來，IPF發病率呈持續上升趨勢，且隨年齡的增加而升高[2]。中醫將IPF歸為“肺痿”和“肺痹”，其治法為益氣養陰、清熱解毒、活血化瘀[3]。研究表明，諸多中藥成分（如黃芩素、雷公藤內酯、芍藥苷等）都顯現出了較好的IPF治療效果[4―7]。以中醫藥理論和傳統用法為線索，從中藥成分中開發治療IPF新藥的前體化合物具有重要價值。

黑面神Breynia fruticosa（Linn.）Hook.f為大戟科黑面神屬植物，以干燥嫩枝葉及根入藥，其性涼，微苦，歸心、肝、肺經[8]。黑面神具有抗炎、抗病毒和免疫抑制等藥理作用[9]，由其組成的相關制劑可用于治療慢性支氣管炎[10]。本課題組前期從黑面神提取物中分離出了多種化合物，并進行初步藥效篩選后發現其中的蒙花苷具有良好的抗肺纖維化藥效。

據文獻報道，蒙花苷具有抗炎鎮痛、抗氧化、抗衰老等作用[11]，而肺纖維化與炎癥、氧化等有密切關聯[1]。肺纖維化伴隨著炎癥發生和細胞因子釋放。轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）作為主要致肺纖維化的細胞因子，可促進膠原蛋白產生，進而導致纖維沉積[12]。TGF-β1致肺纖維化作用與其下游的胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路密切相關，在多種肺纖維化模型和病理組織中均發現磷酸化ERK（p-ERK）表達上調[13]。因此，本研究通過構建體內外肺纖維化模型，探討蒙花苷對肺纖維化的改善作用，并基于炎癥和ERK通路初步考察其作用機制，為抗IPF的新藥研究提供實驗基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有HY-LWH03型微量液體氣管內霧化裝置（北京元森凱德生物技術有限公司）；MULTISKAN型酶標儀（美國PerkinElmer公司）；ECLIPSE TI2-A型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；2-16R型低溫高速離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）；MCO-18AICUUV型CO2細胞培養箱（日本PHCbi公司）；ChemiDoc MP型化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有蒙花苷對照品（四川萃益潤生物科技有限公司，批號CYR-M0074210415，純度98.5%），注射用鹽酸博萊霉素（日本化藥株式會社，批號Y00720，規格15 mg/瓶），吡非尼酮膠囊（北京康蒂尼藥業股份有限公司，批號20211105，規格100 mg/顆），TGF-β1（美國Peprotech公司，批號1020209），HFL1細胞專用培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司），兔源α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（type Ⅰ collagen，Collagen Ⅰ）多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Cell Signaling公司，批號分別為8685T、72026T、7074P2），兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceral‐dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）抗體（美國Affinity公司，批號分別為AF7021、AF0155、AF1015），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和TGF-β1酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司，批號分別為A28220233、A98111123），白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號202203），二氨基聯苯胺（diaminobenzi‐dine，DAB）顯色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號G1212）；水為自制純化水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性C57BL/6J小鼠，共40只，8周齡，體質量（20±2） g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（粵）2022-0002，質量合格證號為44007200100881。檢疫合格后將其飼養于中山市中醫院中藥藥理實驗室動物房中（屏障環境），動物使用許可證號為SYXK（粵）2020-0109。飼養條件為環境溫度20～24 ℃，相對濕度50%～70%，明暗交替各12 h。所有動物實驗流程均通過中山市中醫院動物倫理委員會審核，批準文號為AEWC-2022034。

1.4 細胞株

人胚肺成纖維細胞HFL1購自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號CL-0106）。

2 方法

2.1 體內實驗

2.1.1 動物分組、造模及給藥 將小鼠適應性飼養1周后，按體質量大小采用區間隨機分組法分成正常組、模型組、蒙花苷低劑量組、蒙花苷高劑量組和陽性對照組，每組8只。除正常組外，其余各組小鼠均腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，然后將其固定于操作臺上，通過微量液體氣管內霧化裝置迅速給予每只小鼠50 μL博萊霉素（劑量為3 mg/kg）制備肺纖維化模型[14]；正常組小鼠則以同樣方式給予等體積生理鹽水。造模24 h后，蒙花苷低、高劑量組小鼠灌胃12.5、25 mg/kg蒙花苷（溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，劑量根據預實驗結果設置），陽性對照組小鼠灌胃200 mg/kg吡非尼酮（溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，劑量為臨床等效劑量），正常組和模型組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。每日給藥1次，連續14 d。實驗過程中，小鼠自由飲水及進食。

2.1.2 小鼠一般情況觀察 實驗過程中，每天觀察各組小鼠的活動、毛發、飲食、體質量等一般情況。

2.1.3 取材 末次給藥前，記錄各組小鼠的體質量。末次給藥2 h后，麻醉小鼠并摘眼球取血，將得到的全血在4 ℃條件下靜置2 h，然后以3 500 r/min離心15 min，收集上層血清，將其凍存于－80 ℃冰箱中待測。采血后，處死小鼠，并解剖剝離其肺組織。

2.1.4 肺指數測定 稱定剝離得到的干凈肺組織的質量，按下列公式計算小鼠肺指數：肺指數（mg/g）＝肺質量（mg）/末次給藥前小鼠體質量（g）。

2.1.5 肺組織病理學檢查 取各組小鼠左肺組織適量，置于福爾馬林溶液中固定24 h，經脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）后，常規進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Mas‐son染色，使用光學顯微鏡觀察肺組織病理形態并采集圖像。參照Ashcroft評分標準分別進行肺纖維化評分，評分越高表明肺纖維化程度越嚴重：0分——正常肺組織；1分——肺泡壁或支氣管壁輕微增厚；3分——肺泡壁或支氣管壁中度增厚，但肺泡結構沒有明顯破壞；5分——條索狀纖維帶或小范圍纖維灶形成，肺泡結構明顯破壞；7分——肺泡結構嚴重變形，廣泛的纖維灶形成，呈“蜂窩肺”；8分——肺組織全視野纖維化病變；2、4、6分的病變嚴重程度介于相應分數之間[15]。

2.1.6 血清及肺組織中炎癥指標檢測 取“2.1.3”項下血清，常規解凍后按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中TGF-β1、TNF-α水平；取右肺組織，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）制備組織勻漿，按照ELISA試劑盒說明書檢測肺組織勻漿中IL-6水平。

2.1.7 肺組織中ERK及炎癥相關通路蛋白表達檢測 采用免疫組化法進行檢測。制備小鼠肺組織切片（厚度3 μm），常規脫蠟及處理后，分別加入TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ、p-ERK1/2抗體（稀釋比例均為1∶200），按照試劑盒說明方法操作，封片后顯微鏡觀察，采集圖像并進行分析。以棕黃色顆粒沉積為陽性表達，用Image-Pro Plus 6.0軟件計算各蛋白的平均光密度值。

2.2 體外實驗

2.2.1 細胞培養 將HFL1細胞接種于HFL1細胞專用培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每隔3 d進行傳代換液1次，保證細胞活力為最佳狀態。

2.2.2 細胞形態學觀察 取處于對數生長期且狀態良好的HFL1細胞接種于6孔板中，每孔細胞數約為1×105個，常規培養，次日貼壁后，將細胞分為空白組、模型組和蒙花苷低、中、高濃度組。其中，空白組加培養基；模型組加入TGF-β1（10 ng/mL）溶液刺激形成肺纖維化細胞模型[16]；蒙花苷低、中、高濃度組分別加入3.7、7.4、14.8 mg/L蒙花苷（質量濃度根據預實驗結果設置），同時加入TGF-β1（10 ng/mL）溶液。培養48 h后，于倒置顯微鏡下拍照并觀察HFL1細胞的形態學變化。

2.2.3 細胞中ERK及炎癥相關通路蛋白表達檢測 采用Western blot法進行檢測。HFL1細胞的接種、分組及給藥方式均同“2.2.2”項下。培養結束后加入RIPA裂解液裂解細胞，離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），收集上清液，采用BCA法測定上清液中總蛋白濃度，加入Loading buffer，96 ℃金屬浴煮10 min使蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白組分（電壓70～120 V，時間1.5 h），濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上（恒流300 mA，時間2 h），用5%脫脂奶粉封閉2 h，以PBST洗膜3次；加入α-SMA、Collagen Ⅰ、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，以PBST洗膜3次；加入二抗（稀釋比例為1∶10 000），室溫孵育2 h。采用化學發光成像系統曝光并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以p-ERK1/2蛋白與ERK1/2蛋白條帶灰度值的比值表示p-ERK1/2蛋白的表達水平，其余則以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 體內實驗結果

3.1.1 蒙花苷對小鼠一般情況及肺指數的影響 與正常組比較，模型組小鼠攝食量、飲水量日漸減少，行動遲緩，皮毛粗糙、脫落嚴重，行為懶散，且身體機能有明顯下降，主要表現為肢體協調性差、動作不靈敏，出現呼吸不暢、異常呼吸音，體質量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，蒙花苷高劑量組和陽性對照組小鼠的上述癥狀和表現均明顯好轉，體質量顯著升高（P＜0.05）。肺指數測定結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肺指數顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，蒙花苷高劑量組和陽性對照組小鼠肺指數均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組小鼠的體質量、肺指數測定結果（±s，n＝8）

表1 各組小鼠的體質量、肺指數測定結果（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對照組體質量/g 21.64±0.39 15.35±0.74a 16.91±0.65b 17.13±0.43 17.99±0.41b肺指數/（mg/g）6.37±0.11 22.61±1.47a 19.18±1.16 15.91±0.98b 17.02±0.63b

3.1.2 蒙花苷對肺組織病理學變化的影響 正常組小鼠肺組織結構正常，肺泡結構完整，無病理相關的炎癥浸染、細胞壞死、纖維化等現象；與正常組比較，模型組小鼠肺泡壁顯著增厚，肺泡均呈病理狀態，存在大量炎癥浸染及細胞纖維化病變（見圖1、圖2箭頭處），HE染色評分和Masson染色評分均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織炎癥病變均顯著減輕，肺泡壁增厚顯著改善，纖維化沉積顯著減輕，炎癥浸染顯著改善，HE染色評分和Masson染色評分均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1、圖2、表2。

圖1 蒙花苷對模型小鼠肺組織纖維化的影響（HE染色，×100）

圖2 蒙花苷對模型小鼠肺組織纖維化的影響（Masson染色，×100）

表2 各組小鼠肺組織HE染色和Masson染色評分結果（±s，n＝8，分）

表2 各組小鼠肺組織HE染色和Masson染色評分結果（±s，n＝8，分）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對照組HE染色1.17±0.30 5.67±0.33a 4.17±0.47b 3.33±0.42b 3.83±0.40b Masson染色1.33±0.21 5.33±0.21a 4.33±0.21b 3.66±0.21b 3.83±0.31b

3.1.3 蒙花苷對小鼠血清及肺組織中炎癥因子水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清中TGF-β1、TNF-α及肺組織中IL-6水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠上述指標水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組小鼠血清中TNF-α、TGF-β1及肺組織中IL-6水平測定結果（±s，n＝8，pg/mL）

表3 各組小鼠血清中TNF-α、TGF-β1及肺組織中IL-6水平測定結果（±s，n＝8，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

肺組織IL-6 26.62±0.82 38.08±1.99a 31.92±1.57b 32.49±1.43b 32.85±1.47b組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對照組血清TNF-α 21.79±0.97 31.08±2.17a 22.45±1.76b 19.32±2.27c 24.19±2.66b血清TGF-β1 87.15±4.31 132.50±5.43a 86.74±5.58c 72.58±3.63c 98.02±2.01c

3.1.4 蒙花苷對肺組織中ERK及炎癥相關通路蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肺組織中α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達均顯著上調（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織中上述蛋白表達均顯著下調（P＜0.05）。結果見圖3、表4。

表4 各組小鼠肺組織中ERK及炎癥相關通路蛋白表達的光密度值測定結果（±s，n＝8）

表4 各組小鼠肺組織中ERK及炎癥相關通路蛋白表達的光密度值測定結果（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組蒙花苷低劑量組蒙花苷高劑量組陽性對照組α-SMA 0.13±0.01 0.22±0.01a 0.19±0.02b 0.17±0.01b 0.14±0.01b TGF-β1 0.12±0.01 0.17±0.01a 0.16±0.01b 0.14±0.01b 0.13±0.01b CollagenⅠ0.16±0.01 0.26±0.01a 0.16±0.01b 0.15±0.01b 0.19±0.01b p-ERK1/2 0.15±0.02 0.20±0.01a 0.16±0.01b 0.13±0.01b 0.17±0.02b

圖3 各組小鼠肺組織中α-SMA、TGF-β1、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達的免疫組化圖（×100）

3.2 體外實驗結果

3.2.1 蒙花苷對HFL1細胞形態的影響 與空白組比較，模型組HFL1細胞的密度變大，增殖明顯，細胞形態從邊界清晰、規則梭形變成邊界模糊、扁平化梭形結構。與模型組比較，蒙花苷各濃度組細胞的密度變小，增殖明顯受到抑制，細胞形態逐漸接近空白組，且呈濃度依賴性趨勢，這說明蒙花苷可抑制TGF-β1誘導的HFL1細胞的增殖和分化。結果見圖4。

圖4 各組HFL1細胞的形態學觀察顯微圖（×100）

3.2.2 蒙花苷對HFL1細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ及p-ERK1/2蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達均顯著上調（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，蒙花苷高濃度組細胞中上述蛋白及蒙花苷中濃度組細胞中p-ERK1/2蛋白的表達均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖5、表5。

圖5 各組細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達的電泳圖

表5 各組細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

表5 各組細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和p-ERK1/2蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與空白組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05；d：與模型組比較，P＜0.01

p-ERK1/2/ERK1/2 1.00±0.07 1.61±0.11a 1.19±0.07 0.83±0.03c 0.76±0.08c組別空白組模型組蒙花苷低濃度組蒙花苷中濃度組蒙花苷高濃度組α-SMA/GAPDH 1.00±0.15 1.99±0.09a 1.57±0.16 1.57±0.16 1.25±0.14c CollagenⅠ/GAPDH 1.00±0.03 2.11±0.14b 2.15±0.03 1.94±0.17 0.55±0.23d

4 討論

慢性炎癥反應是肺纖維化發病的主要機制之一，而膠原蛋白合成、致纖維化細胞因子釋放、纖維沉積等也是目前抗肺纖維化研究的重要途徑[17]。目前，臨床常用吡非尼酮等化學藥來延緩肺纖維化的進展，減少纖維化相關蛋白和細胞因子產生以及降低ECM的合成和積聚[18]，因此本研究選擇吡非尼酮作為陽性藥物進行對照研究。肺纖維化的進程與肺組織的炎癥發生高度相關，TGF-β1作為致纖維化的一個關鍵炎癥因子，一直受到科學界的廣泛關注[19]。在肺組織中，TGF-β1能夠刺激成纖維細胞促進ECM的合成和沉積，進而促進其他炎癥因子（如TNF-α、IL-6等）的大量釋放，而炎癥因子可以介導纖維增生，并進一步活化炎癥細胞，從而形成一系列連鎖反應，產生級聯放大效應，最終導致肺纖維化[19]。本研究結果表明，蒙花苷能夠降低肺纖維化模型小鼠體內炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-6的水平。此外，相比于模型組，蒙花苷給藥組小鼠體質量、肺指數均有不同程度改善，說明其具有改善肺纖維化的效果。

在肺纖維化體內模型中，肌成纖維細胞會過度表達α-SMA并分泌ECM相關蛋白，尤其是Collagen Ⅰ蛋白，這會進一步造成ECM沉積，最終演化成纖維化組織[5]。因此，α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白作為肺纖維化的標志性蛋白，常作為評判肺纖維化程度的重要指標。TGF-β1是肺纖維炎癥機制中的關鍵靶點，而ERK通路是TGF-β1的下游信號通路。p-ERK1/2蛋白作為ERK通路的關鍵蛋白，在ERK通路中起到重要調控作用[13]。相關研究發現，p-ERK1/2蛋白表達增加會進一步誘導肺纖維化的發生[13]。本研究在體內實驗中通過免疫組化染色發現，蒙花苷能夠顯著下調肺纖維化標志性蛋白α-SMA、CollagenⅠ的表達，降低小鼠肺組織中p-ERK1/2蛋白表達；而在體外實驗中，Western blot結果也顯示出了相同的趨勢。因此，筆者推測蒙花苷可能是基于ERK通路起到改善肺纖維化的作用。

綜上所述，本研究經過體內外實驗證實了蒙花苷可能是通過調控ERK及炎癥相關通路，抑制炎癥因子釋放來改善炎癥浸潤，從而發揮抗肺纖維化作用，但其具體作用機制仍有待進一步研究。

（利益沖突：所有作者均聲明不存在任何利益沖突）