廣西煙草棒孢霉葉斑病菌鑒定及毒素蛋白亞型檢測

雷雪梅，桑維鈞*，李昊熙，盧燕回，王五權，孔 菲，安宣鮮，楊茂發

(1.貴州大學 煙草學院/貴州省煙草品質研究重點實驗室,貴州 貴陽 550025；2.中國煙草總公司 廣西壯族自治區公司煙葉處,廣西 南寧 530023)

煙草棒孢霉葉斑病最早于1973年在尼日利亞發現[1]。我國棒孢霉屬病菌引起的煙草葉斑病于1998年在貴州發現，煙草棒孢霉葉斑病菌鑒定為多主棒孢霉Corynesporacassiicola[2-3]。2012年在廣西首次發現煙草棒孢霉葉斑病，其病原菌鑒定為多主棒孢霉[4]。2015年進行了廣西煙草棒孢霉葉斑病菌室內殺菌劑篩選[5]，之后有研究發現咪鮮胺、氟啶胺對廣西煙草棒孢霉葉斑病的抑菌效果較好，且該病菌對QoIs類殺菌劑有耐藥性，但抗性相關的位點未出現Cytb基因突變[6]。煙草棒孢霉葉斑病主要危害中下部葉片，高溫高濕的氣候會促進該病害的發生與蔓延，其菌絲生長、分生孢子萌發和產孢的最適溫度范圍在25～30 ℃之間[7-8]。發病葉片采烤后質量下降，直接影響經濟效益[9]。

多主棒孢霉寄主廣泛，可侵染530余種植物[9]，其中包括煙草[2]、橡膠[10]、香蕉[11]、草莓[12]、蓮藕[13]、茄子[14]、苦瓜[15]和黃瓜[16]等，該病原菌代謝產物中具有某種致病因子[17]。2000年Breton等[18]研究發現多主棒孢霉可以合成一種蛋白質毒素“Cassiicolin”。經過試驗進一步推測毒素蛋白與多主棒孢病菌的致病性有關[19-20]，Barthe等[21]對侵染橡膠的多主棒孢Cassiicolin毒素蛋白及其結構進行了分析。研究發現該病菌具有7種毒素蛋白(Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6和Cas7)并開發出毒素類型的特異性引物檢測方法，將檢測不到任何Cassiicolin毒素的基因劃分為Cas0型[22-25]。該毒素蛋白與致病性相關，因此明確其毒素亞型對了解多主棒孢霉的生物學功能有重要意義，同時可為科學防治棒孢霉葉斑病奠定基礎。

多主棒孢霉的Cassiicolin毒素亞型，目前的研究多集中于橡膠樹的落葉病上，近年廣西苦瓜棒孢霉葉斑病上也有研究，而煙草上還未見報道。本文對廣西煙草棒孢霉葉斑病菌進行鑒定并測定其毒素類型，對比橡膠等其他作物上多主棒孢毒素類型的異同，這對了解多主棒孢霉的遺傳進化關系和對煙草棒孢霉葉斑病的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病葉樣本采集

2021年4—7月，分別在廣西壯族自治區賀州市(24°41′N,111°57′E)鐘山縣公安鎮、富川瑤族自治縣富陽鎮、朝東鎮、石家鄉、新華鄉，百色市(23°90′N,106°62′E)靖西市新靖鎮、化峒鎮、地州鎮、同德鄉、隆林各族自治縣德峨鎮、蛇場鄉，河池市(24°70′N,108°09′E)南丹縣六寨鎮、八圩瑤族鄉等煙區采集煙草棒孢霉葉斑病的病葉樣本。

1.1.2供試培養基

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA，青島海博生物技術公司)。稱取46 gPDA培養基，加去離子水定容至1 L，經121 ℃高壓滅菌30 min后備用。

1.1.3供試植物

廣西賀州煙區主栽煙草品種K326；其他寄主植物(橡膠、黃瓜、苦瓜、番茄、香蕉)。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分離與純化

在實驗室對病原菌進行常規組織分離、單孢純化[26]。選取病斑清晰的煙草葉片，利用滅菌后的手術剪在無菌操作臺中剪取病健交界處約0.5 cm×0.5 cm病葉組織，用75%乙醇浸泡3～5 s，然后用無菌水清洗3～5次，轉接于PDA培養基平板上，28 ℃培養。待菌落長出后，在菌落前緣挑取少量菌絲轉接到新的PDA平板上，通過2～3次轉接后，將菌落后純化。將純化的病原菌轉接到PDA試管斜面，4 ℃保存備用。同時采用5 mm直徑打孔器打取菌餅，保存在1 mL的40%無菌甘油凍存管中，-20 ℃保存[27]。圖1為煙草棒孢霉葉斑病田間癥狀圖，與關國經等[2]、張中義等[3]的癥狀描述一致。

圖1 煙草棒孢霉葉斑病田間癥狀圖Fig.1 The symptom of tobacco Corynespora leaf spot(a and b)

1.2.2病原菌診斷

將分離純化的菌株接file:///C:/Users/Administrator/Desktop/%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%8A%A0%E5%B7%A5/SDNS202301/SDNS202301/%E5%B1%B1%E5%9C%B0%E5%86%9C%E4%B8%9A%E7%94%9F%E7%89%A92023%E5%B9%B4%E7%AC%AC1%E6%9C%9F/%E5%B1%B1%E5%9C%B0%E5%86%9C%E4%B8%9A%E7%94%9F%E7%89%A92023%E5%B9%B4%E7%AC%AC1%E6%9C%9F.ebook/images/3bb00483a95be371416a443576906f39.jpg種于PDA平板上(90 mm培養皿，15 mL培養基)，每個培養皿接種1個菌餅于PDA平板中央，每個菌株3個重復，黑暗條件、28 ℃恒溫下培養8 d，觀察菌落的形狀、顏色等[4,28]。

采用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的DNA提取試劑盒提取病原菌DNA，再利用核糖體轉錄間隔區(ITS)[29]、翻譯延伸因子(EF-1α)[30]、β微管蛋白(TUB)[31]等多基因的引物序列對病原菌目的基因進行PCR擴增。將擴增成功的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序。參照GenBank數據庫分析病原菌信息。

1.2.3病原菌毒素蛋白亞型鑒定

利用毒素亞型的特異性引物(表1)進行PCR擴增，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將擴增成功的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果進行BLAST比對分析。

表1 本研究所用鑒定毒素亞型引物信息(Déon[32-33],2012年)Tab.1 Primer information for identifying toxin subtypes used in this study (Déon[32-33],2012)

1.2.4致病性分析

根據毒素類型鑒定，選取本研究中不同毒素類型的代表菌株進行致病性分析。2022年3月將健康的K326煙草、橡膠、黃瓜、苦瓜、番茄、香蕉移栽至廣西壯族自治區賀州市富川瑤族自治縣福利鎮試驗基地。每種移栽植物30株，待植物葉片長至6～8片時進行室外活體接種。在經過黑暗條件、28 ℃恒溫下培養了7 d的PDA平板，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。將菌餅倒置在健康的葉片上，對照作物接同樣大小的新鮮PDA培養基，覆保鮮膜保濕。每個處理3個重復。接種7 d后觀察發病情況。待葉片發病后觀察發病癥狀，并重新分離病原菌，經形態學鑒定發現其特征與本研究的菌株一致。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離與純化

從廣西壯族自治區煙草種植區分離純化得到15株病原菌，保存于貴州大學煙草學院煙草病害研究室，菌株相關信息如表2所示。

表2 本研究病原菌信息Tab.2 Pathogen information of this study

2.2 病原菌診斷與回接驗證

在PDA培養基上的菌落正面為青灰色，菌絲緊密呈絨毛狀(圖2-a)，菌落邊緣呈灰白色；背面以黑青、褐青色為主(圖2-b)。對15株病原菌進行孢子形態觀察，孢子呈棒狀，一端略細，直徑為(29.44～63.26)μm×(5.53～10.14)μm(圖2-c、2-d)。且經回接煙草證明具有致病性，初步鑒定15株病原菌為多主棒孢霉。

注：a.菌落正面；b.菌落背面；c.孢子；d.分生孢子梗。圖2 病原菌形態學鑒定Fig.2 Morphological identification of pathogenic bacteria

利用ITS、EF-1α、TUB等多基因的引物對病原菌目的基因進行PCR擴增，將測序結果進行BLAST比對分析，發現15個菌株與GenBenk里的多主棒孢霉具有99 %以上的同源性。將15個菌株的序列上傳GenBank，登錄號如表3所示。將15個病原菌與GenBank中的棒孢屬菌株和以鏈格孢菌CAU8331為外群構建系統發育進化樹(圖3)。本研究病原菌與C.cassiicola聚于一個分支上，因此，確定本研究15個病原菌為C.cassiicola。

表3 本研究病原菌GenBank登錄號Tab.3 The landing number of the pathogen GenBank in this study

圖3 基于rDNA-ITS、TUB、EF-1α序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS,TUB and EF-1α sequences

將該病原菌接種到煙草葉片上，4 d后葉片接種部位變黑，周圍褪綠變黃明顯(圖4-a)，產生的病斑形態與田間癥狀也十分相似。從接種發病的葉片中再次分離得到菌株，發現與原接種菌株相同，說明該菌株為致病菌。空白對照無發病跡象(圖4-b)。

注：a.菌餅無傷接種4 d癥狀；b.空白對照PDA接種4 d癥狀。圖4 病原菌回接癥狀圖Fig.4 Symptom of pathogen reconnection

2.3 病原菌毒素蛋白亞型鑒定

利用毒素亞型的特異性引物與CasF15和CasR28進行PCR擴增，結果發現在用6種特異性引物時，本研究菌株均無條帶；用CasF15和CasR28時只有一個菌株(CBJT)有條帶，條帶大小500 bp左右，其他菌株均無條帶(圖5)，初步認定為多主棒孢霉菌不產生毒素的亞型Cas0。將擴增出的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果進行BLAST比對分析，發現與Cas7亞型是100%同源性。因此，本研究15個多主棒孢霉菌株中，14個菌株毒素蛋白亞型為Cas0，1個菌株毒素蛋白亞型為Cas7,且已將Cas7序列上傳至GenBank，登錄號為ON803445。

注：M為Marker;8為Cas7基因PCR產物。圖5 電泳凝膠成像圖Fig.5 Electrophoretic gel image

將本試驗中含Cas7毒素的菌株CBJT與GenBank中22個已鑒定的來自不同國家、不同作物、不同毒素亞型的多主棒孢霉菌株，利用毒素基因序列構建ML系統發育樹(圖6)。從圖6可看出相同毒素亞型的多主棒孢霉菌分別聚在一支，其中來自黃瓜、橡膠、馬纓丹寄主的Cas2亞型多主棒孢霉菌聚在一支；來自橡膠寄主的Cas1、Cas3、Cas4、Cas5的多主棒孢霉菌分別各聚一支；來自大豆寄主的Cas6亞型多主棒孢霉菌聚在一支；本試驗含Cas7毒素的菌株CBJT與來自黃瓜寄主的Cas7亞型多主棒孢霉菌聚在一支。

圖6 部分煙草多主棒孢霉菌株Cassiicolin基因系統發育樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the Cassiicolin precursor genes from C.cassiicola isolates of tobacco

2.4 病原菌致病性分析

通過對病原菌毒素蛋白亞型的鑒定，選取了Cas0亞型的兩個代表菌株CZFX-2、CHNL-2和Cas7亞型的菌株CBJT進行致病性分析試驗。由表4可知，Cas0、Cas7亞型均可侵染煙草K326、橡膠、黃瓜、苦瓜、番茄，不能侵染香蕉。結果表明雖然毒素亞型不同，但對本研究中的煙草K326、橡膠(海墾6號、海墾1號)、黃瓜、苦瓜、番茄等作物均有致病性，對香蕉(金粉1號、桂蕉6號)無致病性。

表4 病原菌致病性分析Tab.4 Pathogenicity analysis of pathogenic bacteria

注：a、b、c、d、e、f、g、h分別為菌株CHNL-2無傷接種煙草、番茄、黃瓜、苦瓜、香蕉(金粉1號)、香蕉(桂蕉6號)、橡膠(海墾6號)、橡膠(海墾1號)7 d癥狀；i、j、k、l、m、n、o、p分別為菌株CZFX-2無傷接種煙草、番茄、黃瓜、苦瓜、香蕉(金粉1號)、香蕉(桂蕉6號)、橡膠(海墾6號)、橡膠(海墾1號)7 d癥狀；q、r、s、t、u、v、w、x分別為菌株CBJT無傷接種煙草、番茄、黃瓜、苦瓜、香蕉(金粉1號)、香蕉(桂蕉6號)、橡膠(海墾6號)、橡膠(海墾1號)7 d癥狀。圖7 病原菌致病性測定Fig.7 Determination of pathogenicity of pathogenic bacteria

3 結論與討論

本研究利用ITS、EF-1α、TUB等多基因的引物對病原菌進行系統分析，確定了廣西煙草棒孢霉葉斑病病原菌是多主棒孢霉。該病具體分布區域包括賀州市鐘山縣(公安鎮)、富川瑤族自治縣(新華鄉)，百色市靖西市(新靖鎮、化峒鎮、同德鄉)、河池市南丹縣(六寨鎮)，與譚海文等[4]的研究相比病害發生區域增多。

目前國內多主棒孢霉菌僅存在Cas2和Cas5這2種Cassiicolin毒素亞型，和未檢測到毒素的Cas0亞型。從我國橡膠分離的多主棒孢霉的毒素類型主要是Cas2、Cas5與未檢測到毒素的Cas0亞型[34]；從黃瓜、苦瓜等葫蘆科寄主上分離的多主棒孢霉毒素亞型主要是Cas2和未檢測到毒素的Cas0亞型[35]。上述不同毒素亞型的多主棒孢霉菌能否侵染煙草未見報道。本研究首次測定了廣西15個多主棒孢霉菌株的Cassiicolin毒素亞型，其中14個菌株是Cas0亞型，1個菌株是Cas7亞型。此前我國有關多主棒孢霉菌Cassiicolin毒素亞型的研究未見在煙草上報道，且我國此前也沒有Cas7毒素亞型的報道。本研究測定結果表明，目前廣西煙草棒孢霉病菌中無毒素亞型(Cas0)為優勢群體，這種亞型分布在百色市靖西市(化峒鎮、新靖鎮)，賀州市富川瑤族自治縣(新華鄉)、鐘山縣(公安鎮)，與河池市南丹縣(六寨鎮)。Cas7亞型菌株出現在百色市靖西市(同德鄉)。推測煙草上多主棒孢霉的毒素亞型不存在地區差異。此外，本研究從廣西煙草上分離到的Cas0、Cas7毒素亞型菌株可以侵染煙草，也可以侵染橡膠(海墾6號、海墾1號)、黃瓜、苦瓜、番茄。但是對香蕉(金粉1號、桂蕉6號)不致病。因此推測除毒素外還存在其他致病因子。

本研究結合有關參考序列，進行了病原菌的遺傳關系分析。結果表明煙草棒孢霉葉斑病菌存在遺傳分化，相同毒素類型的菌株分別聚在一支，與Déon等[22]、劉先寶等[36]研究結果一致。本研究鑒定了廣西煙草棒孢霉葉斑病病原菌并首次測定報道煙草棒孢霉病菌的毒素亞型，為該病害的科學防治提供理論基礎。