苗藥有柄石韋降血糖作用及其分子機制研究

常 姣，隋 怡，孫文娟，何韓嬌，胡書苑，童平珍，易 旭，楊武德，龍 毅

(貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

有柄石韋(Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching)為水龍骨科石韋屬植物，功效為利尿通淋、清肺止咳、涼血止血，主要用于治療熱淋、石淋、血淋等癥[1]。最早收載于《神農本草經》，又名石劍箬、金背茶匙、石皮、石蘭、肺心草等[2]。有柄石韋是常用的民族藥之一，苗胞常稱為“銳貓棍”、“黛口掌”(湖南湘西)或“啊咳知”(貴州銅仁)[3-5]，分布地區主要為貴州、四川、云南、湖南、湖北等地[6-7]。石韋的種源繁多，在眾多品種的石韋中，有柄石韋相較于其他石韋具有成熟的栽培繁殖技術，自然界中的儲量多，其黃酮類、多酚類、多糖類含量均較豐富，因其化學成分的多樣性，從而決定其藥理作用的多樣性，石韋的藥理作用為鎮咳祛痰[8]、抗病毒[9]、抗泌尿系統結石[10-11]等，具有較大的研究價值。

糖尿病是因為胰腺中胰島素分泌缺陷或胰腺的生物作用受損而造成的一種代謝性疾病，臨床上以高血糖為主要特征[12]。課題組的前期研究[11]表明有柄石韋具有明顯的利尿通淋的作用，而利尿作用實際上是藥物對水代謝的促進作用，課題組推測有柄石韋對糖代謝也可能具有促進的作用，而這一推測得到了課題組前期的生物信息學研究的支持。故課題組計劃研究有柄石韋降血糖作用及可能的分子機制。然而，網絡藥理學是近些年藥物機制研究的重要方法，網絡藥理學是建立在計算機虛擬計算、高通量組學數據分析等技術基礎上，利用了生物信息學方法，研究多成分-多靶點-多疾病的整合機制，因而具有整體性和系統性的優勢，現廣泛應用于中藥復方及單味藥的作用機制研究中[13]。故本試驗利用高血糖小鼠模型，考查該藥物對糖尿病小鼠血糖的影響，并利用網絡藥理學技術建立了“成分-疾病-通路”的網絡藥理學，探究其可能機制與相關靶點，為該藥物的后期深入研究提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性KM小鼠30只，體質量18～22 g，購自重慶騰鑫有限公司，合格證號SCXK(遼)2015-0001，于溫度22～25 ℃、相對濕度50 %～60 %條件下，自由進食飲水。

1.2 藥材

黔產有柄石韋(20210414)采集于貴州省貴陽市南明區仙人洞，并經貴州中醫藥大學生藥學實驗室楊燁副教授鑒定為水龍骨科植物有柄石韋的新鮮葉及根。

1.3 藥品與試劑

檸檬酸、檸檬酸鈉(2019022088，20190320)均購自天津市致遠化學試劑有限公司；甲醇(20200301)購自重慶萬盛川東化工有限公司。

鏈脲佐菌素(STZ)(1015D057)購自大連美侖生物技術有限公司；鹽酸二甲雙胍片(ABR2313)購自中美上海施貴寶制藥有限公司；水合氯醛水溶液(1125A21)、多聚甲醛溶液(1217A21)均購自北京雷根生物技術有限公司；封閉山羊血清(sl038)、蘇木素染液(G1080)均購自北京索萊寶科技有限公司；EDTA抗原修復液(ZLI-9068)、兔二步法試劑盒(PV-6001)、DAB顯色液(ZLI-9031)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(BJ08089044)購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 儀器

FA2204B型電子天平(上海天美天平儀器有限公司)；800Y高速多功能粉碎機(永康市博歐五金制品有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；306A血測儀(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)；SHHW21.600AII三用恒溫水箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；DM3000生物顯微鏡(德國徠卡儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1有柄石韋水提物的制備

取干燥有柄石韋粗粉100 g，置于圓底燒瓶中加入2倍量體積的蒸餾水浸泡30 min后，再加8倍量體積的蒸餾水沒過藥材，加熱連續回流提取3次，每次1.5 h，趁熱濾過，合并3次濾液，蒸發濃縮至0.5 g/mL，備用。

1.5.2糖尿病小鼠試驗

1.5.2.1糖尿病小鼠模型的建立、分組與給藥

SPF級雄性的KM小鼠30只，隨機選取6只作為正常組，其余小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素進行糖尿病模型的復制[14]，正常對照組腹腔注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。72 h后測定FBG≥11.1mmol/L，視為造模成功。將造模成功后的小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、有柄石韋高、低劑量組(0.5 g/kg、1.0 g/kg)，每組6只。灌胃(i.g)給藥，連續14 d，其中正常組及模型組灌胃等體積的蒸餾水。

從給藥開始后，每天監測小鼠體質量、飲食飲水量的變化情況，并分別于造模前，及造模成功給藥后第7天、14天測定血糖，對比給藥前后血糖含量的變化。

小鼠給藥14 d后處死，迅速取出胰腺組織，用生理鹽水洗滌，吸干水分，迅速放入裝有10 %多聚甲醛的離心管中(液體∶組織=10∶1)，備用。

取出小鼠的胰腺組織，用10 %中性多聚甲醛進行固定，經過脫水、透明、包埋、切片和封片后，進行HE染色，光學顯微鏡鏡檢，圖像采集后分析。

組織切片進行脫蠟至水，切片置于pH 8.0的EDTA緩沖液進行熱修復，滴加適量10% H2O2溶液，避光室溫孵育15 min，使用PBS沖洗。滴加5 %～10 %正常羊血清，室溫孵育5 min，PBS沖洗。加入一抗工作液后置于4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS沖洗。滴加辣根過氧化物酶酶標二抗(HRP)，在室溫下孵育30 min，PBS沖洗。1 mL DAB緩沖液中滴加1～2滴DAB原液，混勻后滴加到切片上，鏡下觀察染色程度。浸入蒸餾水終止反應。蘇木素復染，自來水充分沖洗。1 %酸化乙醇洗脫，自來水充分沖洗。氨水返藍，自來水充分沖洗。采用70 %乙醇、90 %乙醇、無水乙醇各2 min進行梯度脫水干燥，二甲苯透明，風干后中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察結果。

1.5.3統計分析

結果采用SPSS 26.0統計軟件進行處理分析，計量資料用(x±s，n=6)來表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異。

1.5.4網絡藥理學研究

1.5.4.1數據庫

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP數據庫https://tcmspw.com/tcmsp.php)；中藥綜合數據庫(TCMID http://47.100.169.139/tcmid/)；Swiss ADME數據庫(http://www.swissadme.ch/)；Gene Cards數據庫(https://www.genecards.org/)；OMIM數據庫(https://www.omim.org/)；Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)；DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)；微生信數據庫(http://www.bioinformatics.com.cn/basic)

運用TCMSP、Swiss ADMD數據庫以及查閱文獻檢索石韋、有柄石韋、廬山石韋的化學成分，如三萜類[15-17]、黃酮類[18-20]、有機酸類[21-23]等，根據檢索結果，根據限制條件口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進行篩選，得到有柄石韋的活性成分。采用Swiss Target Prediction和SEA數據庫預測活性成分的作用靶點，將活性成分與預測靶點進行整合，刪除重復項。

在Genecard數據中以“diabetes”為關鍵詞，搜索糖尿病相關靶點的基因名，并以相關性評分大于等于中位數進行多次篩選，然后再與OMIM中搜索關鍵詞“diabetes”檢索得到的所有糖尿病相關靶點的基因名進行去重整合，從而得到糖尿病疾病靶點的基因名。

將有柄石韋對應的成分及靶點等匯總分類建立網絡文件與屬性文件，將兩個文件導入Cytoscape3.9.1中，構建藥物-成分-靶點網絡圖，以節點度值的大小進行可視化分析。

將藥物成分靶點與糖尿病疾病靶點通過Venny2.1.0將兩者的靶點進行繪制韋恩并取交集，整理共同的靶基因。交集靶點分別和有效成分韋恩交集并取交集靶點，最后匯總所有交集靶點信息。導入Cytoscape3.9.1軟件中進行可視化分析。

將交集靶點導入STRING 11.5數據庫中構建PPI網絡，根據自己需求進行物種類別及閾值設置，分別為“Homo sapiens”，“medium confidence(0.400)”，以TSV格式導出結果，Cytoscape3.9.1軟件進行可視化分析。

為了了解成分與疾病的交集靶點可能涉及到的信號通路、生物進程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)等信息，將“1.5.4.5項”下的結果導入DAVID數據庫中，以“OFFICILA_GENE_SYMBOL”為標識符，以“Homo sapiens”為物種進行GO分析和KEGG信號通路富集分析，下載分析文件，按照Pvalue值排序，最終設定閾值為P<0.05，篩選相關信息，分析結果以氣泡圖形式予以展示。

根據“1.5.4.7”項下的結果，構建藥物-靶點-通路-疾病網絡，找出通路對應靶點，以及靶點對應有效成分，將其文件導入Cytoscape 3.9.1軟件中進行可視化分析，根據度值大小篩選出核心成分及靶點。

2 結果與分析

2.1 糖尿病小鼠試驗結果

2.1.1糖尿病小鼠的一般指標

與正常對照組相比較，模型組小鼠毛色灰暗，反應遲鈍，出現多飲多食多尿的現象，墊料潮濕。給藥14 d后，各給藥組小鼠體重明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.01)，如表1所示。飲食飲水量變化不明顯，差異不具有顯著性差異(P>0.05)，如表2所示，說明有柄石韋能夠使糖尿病小鼠體質量逐漸增加，但短時間內不能有效改善糖尿病小鼠飲食飲水量。

表1 糖尿病小鼠體質量Tab.1 Results of body weight(food intake and water intake of diabetic mice)

2.1.2糖尿病小鼠FBG的影響

由表3結果可知，模型組小鼠的FBG值較正常組小鼠的FBG值明顯升高(P<0.05)；給藥7 d，模型組小鼠的血糖顯著升高，各給藥組之間無顯著性差異。給藥14 d后，與模型組比較，各給藥組小鼠的FBG降低，差異具有極顯著性差異(P<0.01)，說明有柄石韋水提物能有效降低糖尿病小鼠FBG，見圖1。

表3 糖尿病小鼠給藥后FBG結果Tab.3 Results of FBG in diabetic mice after administration

圖1 糖尿病小鼠給藥第二周FBG結果柱狀圖Fig.1 Histogram of FBG results in diabetic mice at the second

2.1.3糖尿病小鼠胰腺組織HE染色病理切片觀察

結果如圖2，和正常組相比較，模型組小鼠的胰島β細胞核皺縮，排列不規則，邊界不明顯；與模型組小鼠相比較，給藥組小鼠的胰島β細胞明顯改善，細胞形態較完整，細胞邊緣較清晰。結果表明，有柄石韋可以改善糖尿病小鼠胰腺組織的病理損傷，且高劑量組小鼠胰腺改善更明顯。

注：a、b、c、d、e分別為正常組、模型組、二甲雙胍組、有柄石韋低劑量組、有柄石韋高劑量組。圖2 糖尿病小鼠胰胰腺組織HE染色觀察結果(40X)Fig.2 HE staining of pancreatic tissue in diabetic mice(40X)

2.1.4糖尿病小鼠胰腺組織免疫組化胰島素的表達

模型組小鼠的胰島細胞數目較正常組明顯減少，其結果與HE染色的結果一致，此外，還可以觀察到胰島內胰島素的表達明顯減少；與模型組比較，給藥后，胰島內胰島素的表達有不同程度的增加(圖3)。

注：a、b、c、d、e分別為正常組、模型組、二甲雙胍組、有柄石韋低劑量組、有柄石韋高劑量組。圖3 糖尿病小鼠胰腺組織免疫組化觀察(40X)Fig.3 Immunohistochemical observation of pancreatic tissue in diabetic mice (40 X)

2.2 網絡藥理學結果

2.2.1有柄石韋有效成分及靶點篩選

通過查閱文獻，以及在數據庫TCMSP與Swiss ADME中，以OB≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，最后篩選出有柄石韋中的9種成分β-谷甾醇、芒果苷、山奈酚、奎寧酸、圣草酚等納入后續研究(表4)，并采用Swiss Target Prediction 和SEA數據庫預測活性成分的潛在作用靶點，將活性成分與預測靶點進行整合，刪除重復值后得到321個成分靶點。

表4 有柄石韋主要有效成分Tab.4 Main active components of P.petiolosa

2.2.2糖尿病靶點篩選

以“糖尿病”為關鍵詞在Gene Cards、OMIM數據庫挖掘出所有相關靶點，并下載數據，根據中位數進行多次篩選后得到1687個靶點，成分靶點與疾病靶點交集后，共有82個交集靶點。

2.2.3靶點網絡圖構建

將上述檢索到的藥物有效成分及對應的靶點構建有柄石韋藥物-成分-靶點網絡圖，由330個節點和589條邊組成結果，如圖4所示。再將交集靶點分別與9個有效成分靶點進行交集，得到162個靶點，刪除重復后得到82個靶點。使用Cytoscape3.9.1軟件構建疾病-成分-靶點圖，該網絡由92個節點，171條邊組成，按照度值進行排序，前三位為山奈酚(度值=30)、奎寧酸(度值=29)、圣草酚(度值=28)，網絡中每個成分都對應2個及以上靶點，說明中藥有柄石韋在治療糖尿病時，是以多成分、多靶點的共同作用來實現的(圖5)。

2.2.4PPI網絡構建

將交集靶點導入STRING 11.1數據庫構建初始PPI網絡(a)，導入Cytoscape3.9.1軟件進行優化優化后的網絡由82個節點，745條邊組成。選取度值大于30的15個核心靶點進一步優化，其網絡圖由15個節點，94條邊組成，分別為：AKT1、HIF1A、PPARG、FGF2、PTGS2、GSK3、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、PTPN11、MMP9、MAPK3、VEGFA(圖6)，這些靶點與其他靶點關聯度密切，可能在治療糖尿病占據重要地位，為治療糖尿病的核心靶點。

注：a、b、c分別表示初始PPI網絡圖、優化PPI網絡圖、核心子網絡圖。圖6 PPI網絡圖Fig.6 PPI network diagram

2.2.5KEGG信號通路分析和GO富集分析

將在DAVID數據庫中分析得到的數據先按P-value值大小排序再以閾值為P<0.005篩選并在微生信中作圖，如圖7所示。KEGG富集分析共有93條信號通路滿足要求，再根據count值選取前20條進行作圖，結果主要涉及到癌癥中的途徑、阿爾茲海默癥、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等信號通路(a)，前20條通路相關信息見表7；BP結果共有76個條目，主要涉及到RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉運的負調控、信號轉導、MAPK級聯途徑等生物學過程；CC結果共有10個條目，主要與質膜胞質側的外部成分、分泌顆粒腔、富含ficolin-1的顆粒腔、晚期胞內體等細胞組分有關；MF結果共有31個條目，主要涉及到DNA結合、鋅離子結合、序列特異性DNA結合、ATP結合等分子功能。GO結果均取前10個條目作圖(b)。

圖7 KEGG(Top 20)和GO(Top 10)富集圖Fig.7 enrichment diagram of KEGG(Top 20) and GO(Top 10)

表5 前20條核心靶點富集分析結果Tab.5 Enrichment analysis results of the first 20 core targets

2.2.6藥物靶點-通路-交集靶點網絡構建

根據“2.2.5”項的結果篩選出前20條通路所對應的靶點、靶點對應的有效成分，結果如圖8所示。以介度、緊密度以及度值的大小進一步分析出有柄石韋治療糖尿病的主要成分及核心靶點。結果顯示主要成分是奎寧酸quercetin、山奈酚kaempferol、圣草酚eriodictyol、去氫二異丁香酚dehydrodiisoeugenol(表6)。核心靶點前15個為：AKT1、MAPK3、PIK3R1、MAP2K1、EGFR、RAF1、MTOR、VEGFA、IGF1R、MET、BRAF、SRC、GSK3B、FGF2、ESR1。與PPI網絡的前15個核心靶點對比，有9個共同靶點(AKT1、FGF2、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、MAPK3、VEGFA)。

圖8 藥物-靶點-通路-疾病網絡Fig.8 Drug-target-pathway-disease network

表6 有效成分網絡拓撲學參數Tab.6 Active ingredient network topology parameters

3 結論與討論

本次試驗發現，有柄石韋水提物能有效降低STZ所致糖尿病小鼠的FBG，對胰島細胞具有保護與修護作用，并能在一定程度上促進胰島素的分泌。

網絡藥理學中KEGG富集通路結果顯示有柄石韋治療糖尿病的過程可能與癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等有關，且與AKT1、FGF2、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、MAPK3、VEGFA靶點密切相關。PI3K-Akt信號通路與許多重要的生命活動比如細胞的生長、凋亡等密切相關[24]。遲毓婧等[25]的研究中發現PI3K-Akt信號通路是胰島素調控血糖平衡的關鍵通路之一。研究顯示，PI3K-Akt信號通路與胰島素抵抗(IR)相關疾病的關系密切，胰島素以及其他相關因素的刺激會導致PI3K和Akt的上調，均可啟動整個PI3K-Akt信號通路的傳導[26，27]。而AKT1蛋白參與多種生物學過程，如細胞的增殖、生長、胰島素信號傳導等方面密切相關[28]，且它激活依賴PI3K途徑，試驗結果也顯示了有柄石韋對胰島β細胞具有增殖、修復作用，故推測靶點AKT1可能是有柄石韋治療糖尿病的關鍵靶點，從而使有柄石韋對胰島β細胞進行修復來達到降血糖的目的。