貴州都勻仙女蝦的分子鑒定

姚俊杰，何浩宇，陳 江，紀 達，張書海

(貴州大學 漁業資源與環境研究中心，貴州 貴陽 550025)

仙女蝦(fairy shrimps)是節肢動物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，鰓足亞綱(Branchiopoda)，無背甲目(Anostraca)一類物種的總稱[1]。這類物種是典型的臨時池塘棲息者，它們通常生長和成熟都很快，以適應短暫的生長季節，生命周期一般在1～3個月[2]。仙女蝦在甲殼綱動物的分類單元中是最具多樣性的[3]，在世界范圍內有10科300多個物種[4]。目前，仙女蝦作為養殖魚蝦的飼料受到了一些關注[5-6]，但是由于仙女蝦的新種還在不斷出現，仙女蝦的形態學鑒定方面主要局限于成體，并且對于仙女蝦的物種鑒定主要依據顯著的幾個形態特征來進行區分，如釵額蟲科物種主要依據雄性第二觸角和前附肢進行區分[7]，而彎頭蟲科主要依據雄性觸角和四面體的卵來區分[8]，除了這些顯著的形態特征之外，其他定性和定量的形態特征往往被忽視，對形態相似的近緣種難以進行有效鑒定[9]。

隨著分子生物學技術的發展和不斷完善，分子鑒定理論和技術已被廣泛應用于動物分類學研究領域。其中，線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因(COI)已被廣泛采納為通用的標準條形碼基因片段，在仙女蝦系統分類中得到應用。例如Luki等[10]利用COI基因和其他基因片段對仙女蝦Branchipusschaefferi進行了系統發育分析，確定了B.schaefferi的四個主要進化分支。Ketmaier等[11]采用COI基因序列分析了意大利仙女蝦屬Chirocephalus的6個物種間的遺傳分化水平。

16SrRNA長度適中，具有較高的保守性，進化速度相對緩慢，能提供足夠的信息，相比于COI基因，16SrRNA基因序列片段較易擴增[12]，是一種可靠的用于分子鑒定的核基因片段。16SrRNA是常被用于系統發育和生物多樣性研究的一種重要分子標記。例如，Takahashi等[13]使用16SrRNA與COI基因對日本北部(Shiretoko和Chokai)以及俄羅斯遠東地區(Khanka)的Eubranchipusasanumain.sp.、Eubranchipushatanakain.sp.和Eubranchipuskhankanusn.sp.進行了分子鑒定，以分子數據描述了這3個仙女蝦新種。Deiner等[14]使用16SrRNA與COI基因對春池仙女蝦(Branchinectalynchi)進行了測序，分析了物種分布范圍內的區域種群結構和潛在管理單元。

2021年9月在貴州省都勻市甲登村一池塘內發現一種仙女蝦，通過形態觀察，并以線粒體COI基因和16SrRNA基因片段進行序列測定和比對分析，對該仙女蝦物種進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

本材料于2021年9月30日采自黔南布依族苗族自治州都勻市壩固鎮甲登村一池塘內(N26°17′33.08″，E 107°44′46.79″)，池塘面積15 m×20 m，水體顏色呈綠色，水質情況為氨氮：0.5 mg/L，亞硝酸鹽：0.005 mg/L，硬度：14.06，溶氧：5.2～5.4 mg/L。捕獲的仙女蝦樣品浸泡于無水乙醇溶液中，-20 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA的提取

取仙女蝦泳足組織約20～30 mg，用蒸餾水洗凈泳足中的酒精，將其剪碎，采用組織基因組提取試劑盒(重慶擎科生物科技有限公司)提取總DNA，獲得的DNA樣品采用分光光度計檢測，取OD值在1.9以上的樣品，置于1.5 mL離心管中-20 ℃保存備用。

1.2.2PCR擴增及序列測定

線粒體COI基因與16SrRNA基因的擴增引物均為通用引物，線粒體COI基因的引物為COIF(5′-CGAGCAGAGTTAGGTCAACCTG-3′)，COIR(5′-GGAAGAGAGAGGAGTAAGAGAACTGC-3′)，16SrRNA基因的引物為16SrRNAF(5′-CTTTTAT-CTTTTTAAGG TCTGGCCT-3′)，16SrRNAR(5′-TA-GGAATTTAATAGTCGAACAGACTACC-3′)。所有引物均由重慶擎科生物科技有限公司合成。PCR擴增的反應體系為25 μL，包括22 μL金牌mix(重慶擎科生物科技有限公司生產)，10 μmol/L的正、反引物各1 μL，DNA模板為1 μL。PCR反應程序為:98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35個循環，最后72 ℃終延伸1 min。每次PCR擴增均設置陰性對照，以防外源DNA分子的污染。擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將膠置于UVP全自動凝膠成像系統上觀察產物長度與濃度，選取條帶亮且單一的PCR原液送至重慶擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

1.2.3數據分析

采用NCBI在線BLAST進行相似性比對分析，以確定擴增序列的種類。將試驗所得序列與GenBank中下載的同源序列利用ClustalX1.81軟件進行排序[15]。采用MEGA v6.0 軟件將COI和16SrRNA基因序列翻譯成蛋白序列，檢測是否有提前終止現象，計算堿基含量和遺傳距離，并構建鄰接(neighbor-joining，NJ)分子系統樹，系統樹各分支的置信度由Bootstrap 1000次循環檢驗[16]。

2 結果與分析

2.1 形態特征描述

本試驗捕獲了50尾都勻仙女蝦，經觀測，該仙女蝦體透明，平均體重為0.018±0.07 g，平均全長15.67±1.99 mm，第一觸角兩根，長度約0.28 mm，第二觸角長約0.02 mm，眼睛一對，突出，尾呈橘紅色，呈Y形，長約0.24 mm，邊緣密生剛毛。以仰泳的方式在池塘中游動(圖1)。

注：a.都勻仙女蝦背面圖;b.都勻仙女蝦尾部(×10)。圖1 都勻仙女蝦形態圖Fig.1 The shape of fairy shrimp in Duyun

2.2 PCR擴增及電泳檢測

對貴州都勻仙女蝦的COI和16SrRNA序列區進行PCR擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分別得到1條長度約為470 bp和750 bp的目的產物(圖2)。

注：M.DL2000 DNA分子量標準；A.引物A擴增出的COI序列；B.引物B擴增出的16S rRNA序列。圖2 仙女蝦COI 基因與16S rRNA基因的PCR擴增條帶Fig.2 PCR amplification bands of COI gene and 16S rRNA gene in the fairy shrimps

2.3 COI、16S rRNA區基因的同源性對都勻仙女蝦的鑒定分析

測序獲得的貴州都勻仙女蝦COI基因與16SrRNA基因片段序列利用NCBI數據庫中的BLAST，與GenBank中已有仙女蝦的COI、16SrRNA基因序列進行多序列比對，發現貴州都勻仙女蝦與釵額蟲科(Thamnocephalidae)的鵠沼枝額蟲(Branchinellakugenumaensis)的COI基因序列(LC311764.1)相似性達到了98.71%，與鵠沼枝額蟲的16SrRNA的基因序列(LC311765.1)相似性達到了98.96%。從同源性分析鑒定來看，都勻仙女蝦可初步確定為釵額蟲科的鵠沼枝額蟲。

2.4 基于COI區基因的遺傳距離與系統進化樹對都勻仙女蝦的鑒定分析

基于COI基因序列計算的不同仙女蝦遺傳距離見表1。都勻仙女蝦與不同仙女蝦物種的遺傳距離在0.017～0.238之間，其中與在日本發現的鵠沼枝額蟲(Branchinellakugenumaensis)遺傳距離僅為0.017，與彎頭蟲科的Streptocephalusdorothae遺傳距離最大，為0.238。基于COI基因的序列分析表明，都勻仙女蝦為釵額蟲科的鵠沼枝額蟲。

選取彎頭蟲科的Streptocephalusdorothae為外類群，基于COI序列以鄰接法構建系統發育樹(圖3)，結果發現貴州都勻仙女蝦與同為枝額蟲屬的Branchinellalongirostris、Branchinellaspinosa為同枝系，驗證了都勻仙女蝦為枝額蟲屬(Branchinella)，都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲聚為一支，置信度為100%，表明都勻仙女蝦為枝額蟲屬的鵠沼枝額蟲。

圖3 基于 COI 基因序列構建的不同仙女蝦物種的鄰接分子系統樹Fig.3 The NJ tree of different fairy shrimp species with the COI gene sequences

2.5 基于16S rRNA區基因的遺傳距離與系統進化樹對都勻仙女蝦的鑒定分析

基于16SrRNA基因序列計算的不同仙女蝦遺傳距離見表2。都勻仙女蝦與其他不同仙女蝦物種遺傳距離范圍在0.000～0.179之間，其中與鵠沼枝額蟲遺傳距離最小，為0.000；與彎頭蟲科的Streptocephalusdorothae遺傳距離最大，為0.179。基于16SrRNA基因序列分析，都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲的遺傳距離為0.000，表明都勻仙女蝦為釵額蟲科的鵠沼枝額蟲。

表2 基于16S rRNA基因序列計算的不同仙女蝦遺傳距離Tab.2 Genetic distance of different fairy shrimps calculated based on 16S rRNA gene sequence

選取彎頭蟲科的Streptocephalusdorothae為外類群，基于16SrRNA序列以鄰接法構建系統發育樹(圖4)，結果發現都勻仙女蝦與同為枝額蟲屬的Branchinellapinderi、Branchinellalamellata、Branchinellatyleri、Branchinellasimplex為同枝系，都勻仙女蝦也歸于枝額蟲屬。都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲聚為一支，置信度為99%，也表明都勻仙女蝦為枝額蟲屬的鵠沼枝額蟲。

圖4 基于16S rRNA基因序列構建的不同仙女蝦物種的鄰接分子系統樹Fig.4 The NJ tree of different fairy shrimp species with the 16S rRNA gene sequences

3 結論與討論

3.1 COI與16S rRNA基因在分子鑒定中的應用

分子鑒定作為形態學鑒定方法的補充手段，被越來越多的水產學者所接受，本研究所采用的COI基因被廣泛用于物種的分子鑒定，自COI基因作為DNA條形碼概念的提出，更是成為物種的分子鑒定與系統發育研究的熱門基因片段。陳媛[17]對蟻屬(Formica)16個種進行形態鑒定與COI基因測序發現，COI基因可以克服形態分類上的局限性，有利于隱藏種的發現以及地方基因多樣性的評估。

COI基因作為遺傳標記能很好的鑒定物種，但由于COI基因是母系遺傳，有著條形碼數據與物種邊界不一致的潛在原因：分類不完善、遺傳信息不充分、譜系分類不完整或親緣雜交[18]。眾多學者也提到單獨使用COI基因序列的有限性[19-20]，因此為防止COI基因不能對物種進行有效的鑒定，需結合其他分子標記深入分析。16SrRNA是一種核糖體基因，能夠很好的反映各物種種屬的進化，多用于種屬鑒定、進化分析等方面[21-23]。例如，Iguchi[21]利用核基因16SrRNA序列鑒定了日本各地深海腹足綱(Buccinum)物種的種間和種內關系。因此，本研究采用線粒體COI基因和核基因16SrRNA基因測序兩種方法對都勻仙女蝦進行鑒定。

3.2 COI與16S rRNA基因鑒定的有效性與都勻仙女蝦可能存在的進化關系

物種種間和種內遺傳距離的大小是進行物種鑒別的主要標準。Hellberg等[24]曾提出使用COI基因進行物種鑒別研究時，認為種內的遺傳距離不得大于2%，至少為同屬內種間遺傳距離的10倍以上才可有效判別物種。基于COI基因的序列分析，都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲的遺傳距離為0.017，同屬內種間遺傳距離平均0.252，種間遺傳距離是種內遺傳距離的14.85倍，同屬種間遺傳距離和種內距離有明顯的間隔區，這一結論初步表明都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲屬于同一物種。而基于16SrRNA基因序列的都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲的遺傳距離為0.000，小于Hebert等[25]計算的甲殼綱同屬物種間的平均遺傳距離(0.154)，屬于種內差異，表明都勻仙女蝦為釵額蟲科的鵠沼枝額蟲。構建鄰接分子系統樹均顯示都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲聚為一支，COI樹與16SrRNA樹的節點支持率分別為100%和99%，說明這兩個節點為獨立分支的結果均可靠。綜上所述，都勻仙女蝦與鵠沼枝額蟲屬于同一物種的結論是可信的。

值得注意的是，在基于16SrRNA基因序列構建的遺傳距離表中，都勻仙女蝦與仙女蝦Branchinellalamellata的遺傳距離較近(0.159)，說明兩種仙女蝦親緣關系較近，存在可能的進化關系，需要結合其他基因進一步分析。

3.3 仙女蝦鵠沼枝額蟲的物種保護與應用

鵠沼枝額蟲是1895年在日本石川縣首次被發現及描述的無背甲目物種[26]，俗稱古根豐年蟲，隸屬于釵額蟲科枝額蟲屬，為淡水仙女蝦，自然分布于中國、日本、朝鮮及印度南部等淡水水域[27]。由于臨時池塘被迅速摧毀，仙女蝦在全球范圍內被認為是一個脆弱的群體，其分布不斷下降[28]。美國瀕危物種法已將仙女蝦列為瀕危物種，為了應對這一挑戰，美國“瀕危物種恢復計劃”要求實施以遺傳數據為依據的再引進計劃，以恢復滅絕的種群[29]。此次發現的鵠沼枝額蟲出現在都勻市甲登村的池塘中，才有機會采到樣品，對其進行鑒定和分析。由于農藥、化肥的施用，目前池塘等水體中，仙女蝦出現的頻率很低。需要對鵠沼枝額蟲等仙女蝦進行必要的保護，一方面，可以進一步認識這個物種的相關生物學特性，另一方面利于保護我國水生生物的多樣性。

鹽水豐年蟲(Artemiasalina)是應用較多的一種仙女蝦，其蟲卵即鹵蟲，鹵蟲含有豐富的蛋白質，氨基酸組成齊全，粗脂肪含量比較高，其中不飽和脂肪酸高于飽和脂肪酸，帶殼卵的不飽和脂肪酸為48.15%，脫殼卵的為54.82%。帶殼卵的飽和脂肪酸是脫殼卵的1.5倍[30]，鹵蟲卵是魚、蝦常用的開口餌料，如用作南美白對蝦(LitopenaeusVannamei)[31]、脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)[32]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[33]等的開口餌料。

鵠沼枝額蟲是淡水種類的仙女蝦，同樣是高蛋白、高氨基酸含量的生物餌料[34]，而其幼體是青蝦(Macrobrachiumnipponense)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、圓尾斗魚(Macropodusocellatu)等淡水水產動物苗種培育的優質開口活餌，有巨大的養殖利用價值[34-35]。