兩類大戟二萜的高分辨ESI－MS/MS質譜裂解規律及診斷離子解析

王天山，付子卓，蔣方龍

（1.熱帶藥用資源化學教育部重點實驗室，海南 海口 571199；2.海南省熱帶藥用植物化學重點實驗室，海南 海口 571199；3.海南師范大學 化學與化工學院，海南 海口 571199）

大戟二萜是大戟屬植物的主要化學成分，通常擁有比較豐富的二萜骨架和大環結構［1］。它們在植物化學、有機化學、藥學和分子生物學方面都有非常重要的作用，但是曼西烷型（Myrsinane）和前曼西烷型（Premyrsinane）二萜等在植物中的含量較少，并已成為制約諸多相關研究發展的瓶頸。曼西烷型和前曼西烷型二萜主要存在于大戟科大戟屬（Euphorbia）植物中，其基本化學結構是具有5/7/6/3和5/7/6多環駢合體系。根據該類物質的骨架轉化和生源分析，前曼西烷型和曼西烷型二萜有直接的生源關系［2］。藥理活性研究發現，此類二萜類化合物擁有非常廣泛的生物活性，比如細胞毒性和抗腫瘤活性、抑菌活性、抗炎活性等，這為從大戟二萜中尋找藥物先導物提供了數據依據［1，3］。隨著一系列新的、高效的色譜技術與波譜技術的不斷融合發展，新化合物和結構新穎的骨架不斷被發現，豐富了大戟二萜的數據庫。Yazdiniapour等［4］從伊朗產的E. gedrosiaca中發現兩種新的曼西烷型二萜多酯化合物，并以紫杉醇作為陽性對照，研究了這些化合物在體外對小鼠黑色素瘤高轉移細胞系B16F10和A375的增殖抑制活性。Flores－Giubi等［5］從大戟（E. boetica）全草的乙醇提取物中發現4類大戟二萜，其中3種是新的前曼西烷型二萜，2種是新的曼西烷型二萜，還有大環續隨子二萜。這些大環續隨子二萜可以促進小鼠體內的神經祖細胞（NPCs）增殖，具有修復受損腦細胞的意義。Laura等［6］采用高壓液相色譜方法從意大利產的地衣大戟（E. myrsinites）中分離純化制備出1種新的阿替生烷型、4種曼西烷型和3種巨大戟烷型大戟二萜，發現部分二萜對小鼠體外單核巨噬細胞J774A.1表現出一定的消炎活性。Huang等［7］從續隨子（E. lathyrism）種子的95%乙醇提取物中發現兩種高度重排的續隨子烷型二萜Euphohyrismoinds A和B，兩者分別具有獨特的四環［10.2.2.01，10.03，7］十六烷和三環［8.4.1.03，7］十五烷型二萜骨架。Wang等［8］采用生源合成的方法發現，在室溫下用三氟化硼－乙醚－乙酸乙酯體系催化大戟因子L1（續隨子烷型二萜）可以合成曼西烷型二萜，闡明了這兩類二萜可能的生物轉化問題，并給出了合成曼西烷型二萜的化學方法，為其生物活性、構效關系和藥理研究等提供了物質保障。

新化合物和新骨架的發現依托于研究方法的不斷創新。近幾年，有很多研究工作者借助GNPS（Global Natural Product Social Molecular Networking）數據庫平臺研究天然產物化學，主要是基于各種類型對照品的二級質譜（MS/MS）數據分析其二級質譜裂解規律和診斷離子，建立特定類型化合物的分子網絡。通過此類分子網絡不僅可以快速且大通量地鑒定中藥的化學成分，挖掘新化合物，還可以為定向獲取活性化合物提供重要的線索，為藥物代謝研究提供新的方法［9－12］。宋少江課題組基于MS/MS的分子網絡策略，從地膽草（ElephantopusscaberL.）中分離得到6種新吉瑪烷型倍半萜內酯，分別命名為Scaberxones A－F；并發現Scaberxones F在10μmol/L時對脂多糖（LPS）誘導小膠質細胞（BV－2）釋放一氧化氮（NO）的水平具有很強的抑制活性，并以此評估了其抗神經炎癥活性［13］。張翠仙課題組采用超高效液相色譜－四極桿飛行時間質譜結合GNPS分子網絡平臺，對中藥炮附片中二萜類生物堿的化學結構進行了快速表征，以13種附子對照品的二級質譜數據為基礎建立GNPS網絡，并結合這些對照品的質譜裂解規律成功鑒定了123個二萜類生物堿化合物，其中有34個化合物為潛在的新化合物［14］。

本研究采用高分辨電噴霧二級質譜技術（HR－ESI－MS/MS）分析兩類15種大戟二萜的質譜裂解規律，闡述這些化合物的診斷離子，以期為此類二萜的質譜鑒定提供科學數據，并為利用分子網絡技術定向分離此類物質提供必要的二級質譜數據和化學結構鑒定思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Q Exactive Focus型四極桿高分辨質譜儀（美國Thermo Scientific有限公司），FA1604型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司），XO－5200DB型超聲波清洗儀（南京先歐儀器制造有限公司），MPC－5V406型醫用藥品冷藏箱（安徽中科都菱股份有限公司）；0.45 μm有機相過濾膜（天津津騰科技有限公司），色譜級甲醇（Marcon Fine Chemicals?有限公司），25%色譜級氨水（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），99.9%純度液氮和99.99%純度液氦（海口金厚特種氣體有限公司）。

15種大戟二萜樣品的化學名稱分別為：Euphorprolitherin B（1），Euphordraculoin M（2），Euphordraculoin R（3），Proliferin A（4），Euphordracunculin A（5），Euphordracunculin B（6），Euphorbialoid F（7），Proliferin C（8），14-Deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoylmyrsinol-14β-acetate（9），Euphorbialoid C（10），Euphorbialoid D（11），3-Propanoate-5-benzoate-7，13，17-triacetate-premyrsinol（12），Euphorbialoid A（13），Falcatin S（14），Euphordraculoin K（15），由中國科學院昆明植物研究所王莉博士提供，化學結構見圖1［15－18］。

圖1 15種曼西烷型和前曼西烷型二萜的化學結構Fig.1 Chemical structures of fifteen myrsinane-type and premyrsinane-type diterpenes

1.2 質譜條件

Q Exactive Focus型質譜儀采用電噴霧離子源（ESI）結合TraceFinder數據分析軟件（version 4.1）進行正/負離子模式掃描。掃描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率70 000，正離子模式噴霧電壓：4.2 kV，負離子模式噴霧電壓：4 kV，蠕動泵半自動進樣速度：5 μL/min。離子傳輸管溫度：350 ℃；鞘氣壓力：34.5 kPa；霧化溫度：常溫；MS/MS模式碰撞能量：10 ~ 50 eV（對各種測試樣品進行手動優化，以獲得豐富的子離子信號）。

1.3 待測樣品溶液的配制

用天平稱取各對照品1.0 mg，分別加入1 mL甲醇中超聲溶解，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，制備單一對照品儲備液，置于藥品儲藏柜中4 ℃保存。測試時將1 mg/mL的儲備溶液稀釋至0.1 mg/mL。

2 結果與討論

本研究選擇的15種大戟二萜化合物，有9種曼西烷型二萜（1 ~ 9）和6種前曼西烷型二萜（10 ~ 15）。電噴霧質譜測試時發現部分樣品的甲醇溶液未能檢出［M + H］+的準分子離子峰，因此向未質子化的樣品滴加1滴25%氨水進行氨化處理以獲得［M + NH4］+的準分子離子峰，此準分子離子丟失中性NH3分子后與［M + H］+的ESI二級質譜裂解行為相同［19］。除［M + H］+/［M + NH4］+準分子離子峰外，實驗中還觀測到［M + Na］+和［M + K］+的準分子離子峰。在進行一級質譜和二級質譜掃描時，根據各化合物的分子量大小選擇合適的掃描范圍。本研究重點分析上述兩類大戟二萜［M + H］+/［M + NH4］+準分子離子的質譜裂解規律，并結合各自的化學結構特點闡述其診斷離子。研究結果表明這些診斷離子主要集中在m/z200 ~ 320區間。

曼西烷型和前曼西烷型大戟二萜含有多個酰氧基，通過分析各化合物相同位置不同酰氧基的差異及其裂解順序發現，酰氧基所受到的斥力大小以及是否含有β-H均會影響其質譜裂解順序，一般斥力大的酰氧基更容易脫離，有β-H的酰氧基優先裂解。借助此類化合物的晶體結構或NOE（Nuclear overhauser enhancement spectroscopy）二維核磁共振實驗數據更有利于理解各個酰氧基之間的相對位置和基團間的距離［5，8］。另外，通過分析這些化合物的［M + Na］+/［M + K］+的二級質譜還發現，最后一個酰氧基或羥基會與加合離子（Na+或K+）結合以羧酸鹽或堿的方式脫離，且同一化合物不同形式的準分子離子在m/z200 ~ 320區間的裂解模式相同（表1）。

表1 4種代表性大戟二萜化合物的串聯質譜碎片離子Table 1 Fragment ions of tandem mass spectrometry for four candidate Euphorbia diterpenoid compounds

（續表1）

2.1 曼西烷型二萜的二級質譜裂解

2.1.1 13，17-環氧-10，18-二氫曼西烷型化合物1 ~ 8的化學結構特點是擁有5/7/6/5四環體系，C-13和C-17通過氧橋鍵合形成一個四氫呋喃環，該四氫呋喃環表現出其裂解特點。化合物1 ~ 6在C-2的氧化位點為羥基或酰氧基，其它的氧化位點均為酰氧基。化合物Euphorprolitherin B（1）的氨化準分子離子m/z788 ［M + NH4］+受到轟擊（10 eV）丟失一個中性NH3分子后，從C-2、C-5、C-7和C-15位連續丟失4個乙酸分子，隨后C-3位（無β-H）的丙酰氧基與加合質子相結合斷掉丙酸分子生成離子m/z457；而m/z353是比m/z457少104 Da的離子，歸屬為C-14位（無H+，無β-H）的苯甲酰基通過苯環2位氫的重排發生酰基裂解生成的醇式離子，繼而其在C-10位丟失最后一個乙酸分子生成醇式二萜骨架離子m/z293。m/z293既可脫水生成m/z275離子，還可依次從四氫呋喃環和C-14位的羥亞甲基結構裂解掉兩個中性小分子HCHO后生成m/z263和m/z233的離子對。相似的，經過C-10位丟失乙烯酮后得到的二醇式骨架離子m/z311相繼裂解掉兩分子甲醛得到另外一對離子m/z281和m/z251；實驗還觀察到離子m/z311從C-11位裂解掉一個丙酮分子生成m/z253。在碎片離子中m/z263→223相差40 Da，這歸屬為從C-11位丟掉一個丙炔分子（圖2）。m/z311、281、251、293、263、233、275、253和223可視為是含有7個氧化位點且沒有羰基的13，17-環氧-10，18-二氫曼西烷型二萜的診斷離子。

圖2 化合物Euphorprolitherin B（1）氨化離子的質譜裂解途徑Fig.2 Proposed fragmentation pathways of ammoniated euphorprolitherin B（1）

化合物Euphorbialoid F（7）只有6個氧化位點，比1 ~ 6在C-2少一個氧化位點，其中C-7被氧化成羰基，其它均為酰氧基。其二級質譜裂解表現為先丟失5分子羧酸，分別為丟失C-5、C-10和C-15位3分子乙酸生成m/z490，接著斷裂C-3位丙酸得到m/z416，最后從C-14位經芳環上的氫重排斷掉煙酰基生成醇酮式二萜骨架m/z311離子，或者直接脫掉煙酸得到m/z293酮式二萜骨架離子。若m/z416離子先從四氫呋喃環裂解掉甲醛分子將得到一個僅次于基峰的強離子信號m/z386，此離子也可斷掉煙酰基或者煙酸生成m/z281和m/z263離子。酮式二萜骨架離子m/z293從C-7位丟失一個中性CO分子，再從C-11處斷裂一分子丙烯分別得到m/z265和m/z223。m/z311-281-251離子簇的裂解模式與化合物1相同，均為丟失兩個甲醛分子。離子m/z233的化學組成為C14H17O+3，根據其含有3個氧原子的特點推測可能是醇酮式二萜骨架離子m/z311的7元環開裂后產生的（圖3紅色箭頭）。

圖3 化合物Euphorbialoid F（7）質子化離子的質譜裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of protonated euphorbialoid F（7）red arrow：m/z 233 ion obtained by seven-membered ring cleavage（紅色箭頭：七元環裂解生成m/z 233離子）

m/z293→265→223展示的是二萜骨架離子脫羰基和丙烯的過程，基本上能夠反映該類物質的化學結構特點。m/z311、293、281、265、263、251、233和223離子反映了化合物7的四氫呋喃環、C-7羰基和C-11異丙烯基的裂解特點，可認為是此類化合物的診斷離子。

化合物7與1的骨架離子m/z293的化學組成相同，但其化學結構并不相同，主要區別在于7可以脫去CO分子（m/z293→265），而1則是脫水（m/z293→275）。還有一個很有意義的鑒別信息是，這兩種化合物都含有m/z233的碎片離子，但是高分辨質譜提示其化學組成并不相同，前者為C14H17O3，后者為C18H17。這兩組碎片離子的差異可以區分這些化合物在C-7位是否含有羰基。

2.1.2 5/7/6/5四環曼西烷型化合物9也是擁有5/7/6/5四環體系的曼西烷型二萜，與1 ~ 8的不同之處是其C-11位為異丙烯基結構。該化合物m/z654［M + H］+的二級質譜裂解是從C-3、C-5、C-7和C-15位脫酸后生成m/z337離子；該離子（m/z337）先從C-14位脫酸再從四氫呋喃環裂解掉甲醛即生成m/z277和m/z247的離子對，反之則生成m/z307和m/z247離子對；若從C-14位經過酰基上的氫重排脫去乙烯酮（CH2CO）則生成醇式二萜骨架m/z295離子。該m/z295離子具有與化合物1的醇式二萜骨架m/z293離子相似的裂解方式，既可脫水得到m/z277，也可從四氫呋喃環和C-14位的羥亞甲基依次裂解掉兩個甲醛分子而生成m/z265和m/z235的離子對（圖4）。由此可見，此類化合物的診斷離子為m/z295、277、265、247和235。

圖4 化合物14-deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoyl-myrsinol-14β-acetate（9）質子化離子的質譜裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of protonated 14-deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoyl-myrsinol-14β-acetate（9）

2.2 5/7/6/3四環前曼西烷型二萜的二級質譜裂解

前曼西烷型二萜的結構特點是比曼西烷型二萜在C環多一個偕二甲基環丙烷單元，形成5/7/6/3四環體系，其各個氧化位點的基團多為羥基、羰基和酰氧基。

以化合物Euphorbialoid C（10）為例對該類型化合物的質譜裂解途徑進行分析，選擇20 eV的碰撞能撞擊［M + H］+可以得到比較豐富的二級質譜碎片離子。二級質譜圖顯示化合物10優先丟失5分子的羧酸：分別從C-7和C-13丟失兩分子乙酸，從C-5丟失一分子苯甲酸，接著從C-3丟失一分子丙酸，最后從C-17（無β-H）經過H-9參與的裂解反應丟失一分子煙酸同時形成一個環丙烷單元，繼而得到二萜骨架的醇酮式m/z295碎片離子（圖5紫色箭頭），若有一個酰氧基開裂即生成m/z313的骨架離子。這兩個骨架離子既有常見的脫水和脫CO的特點，例如m/z295→277→249或者m/z295→267→249，也存在與曼西烷型二萜不同的裂解模式，即關于偕二甲基環丙烷單元的裂解。

通過分析相關碎片離子之間化學組成的變化發現，前曼西烷型二萜存在裂解掉丙烯的中性分子，這是由于經過前幾步脫酸裂解后，偕二甲基環丙烷單元與碳碳雙鍵相連致使三元環的張力進一步增大。離子m/z235和m/z225均比各自的前體離子減少42 Da，所對應的化學組成均為減少C3H6，裂解機理可能是三元環在C10－C11處開裂的同時一個H-20遷移至C-10，并在C-9處裂解掉一個C3H6丙烯分子（如圖5紅色箭頭所示）。離子m/z253比m/z267少14 Da，從離子m/z267的結構看很可能是C-17處的三元環裂解掉CH2后生成雙鍵，此雙鍵可以與其它原有的雙鍵形成更大的共軛體系；m/z253離子的存在說明H-9參與C-17處煙酰氧基的裂解并形成三元環（m/z418→295）的機理是合理的。

圖5 化合物Euphorbialoid C（10）質子化離子的質譜裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of protonated euphorbialoid C（10）red arrow： C3H6 loss； purple arrow： NicOH loss（紅色箭頭：丟失丙烯；紫色箭頭：丟失煙酸）

碎片離子m/z313、295、277、267、253、249和225反映的是前曼西烷型二萜醇酮式骨架的裂解特征，而碎片離子m/z235和m/z225則反映了偕二甲基環丙烷單元的裂解特征。由于這些離子可反映該類型化合物的基本骨架，因此將其視為前曼西烷型二萜的診斷離子。

2.3 診斷離子解析

本文的15種大戟二萜均為多酯類化合物，含有多個氧化位點；酰氧基和羥基裂解后均可生成C= = C雙鍵，所得到的子離子可相應地增加一個不飽和度。根據各類化合物潛在C= = C雙鍵（pRDB值）和母核骨架不飽和度（bRDB值）的總數可以推測二萜骨架離子的質荷比；從裂解規律看，可以將酰氧基和羥基視為一個潛在的不飽和度，羰基有兩個不飽和度（一個潛在不飽和度和一個雙鍵不飽和度），而C= = C雙鍵擁有一個不飽和度（見表2）。

表2 化合物1 ~ 15的潛在RDB值、骨架RDB值以及診斷離子Table 2 The potential RDB，backbone RDB values and diagnostic ions for 1－15

3 結 論

采用高分辨電噴霧質譜研究了大戟二萜中曼西烷型和前曼西烷型二萜的二級質譜裂解行為，并闡述了其診斷離子。通過研究15種樣品的質譜裂解行為發現，在所有的氧化位點上酰氧基最容易脫酸，接下來是羥基脫水和羰基脫去CO分子。當化合物脫去所有的酰氧基后即可生成具有該二萜骨架的離子，以該離子作為母離子所生成的子離子可反映其化學結構特征，因此將這些二萜骨架離子視為診斷離子。對于10，18-二氫曼西烷型化合物（1 ~ 8），借助其診斷離子和碎片離子可以區分C-2位是否存在氧化位點以及是否存在羰基。這些診斷離子信息可為采用質譜技術快速鑒定同類型化合物提供可靠的數據參考，為建立大戟二萜的質譜分子網絡提供必要的數據依據和研究思路。

由于所選擇的樣品種類和數量有限，此研究結果不一定代表所有曼西烷型和前曼西烷型二萜的質譜裂解行為。各個位點氧化態的不同、酰基之間斥力的不同或者存在其它橋環結構等因素都可能影響其質譜裂解方式。