超高效液相色譜－蒸發光散射檢測法同時測定重樓消瘤方中5種皂苷類成分含量

胥愛麗，曹穎男，張素中，邱錦燕，謝燦輝，畢曉黎，肖觀林

（1.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東 廣州 510095；2.廣州新華學院 藥學院，廣東 廣州 510520；3.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095；4.廣州中醫藥大學 第五臨床醫學院，廣東 廣州 510405）

重樓消瘤方由重樓、柴胡、雞血藤、莪術等中藥組成，為臨床上應用多年、具有自主知識產權的抗腫瘤中藥驗方。研究發現其對人肺癌A549細胞在體外具有較高的抑制效果（抑制率> 90%），且能抑制小鼠Lewis肺癌荷瘤模型的腫瘤生長，抗腫瘤效果明顯，對于開發高效低價的抗腫瘤傳統中藥制劑具有重要的意義和價值［1－2］。

中藥的療效與其制劑的質量密切相關，而評價制劑的質量優劣可通過化學成分的含量測定來實現，因此，建立重樓消瘤方與抗腫瘤相關的多成分含量的同時測定方法從而控制制劑質量顯得尤為重要。方中君藥重樓為百合科植物云南重樓的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛的功效［3］，其主要活性成分為甾體皂苷類，包括重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等。研究表明，重樓皂苷在直腸癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均表現出良好的抗腫瘤作用［4－5］。臣藥柴胡為傘形科植物柴胡的干燥根，主要含有揮發油、皂苷、黃酮等成分［3］。柴胡皂苷是柴胡的主要生物活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化損傷、抗纖維化和免疫調節等作用［6］。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d均具有較好的抗腫瘤效果，對于肝癌、結腸癌、乳腺癌等多種癌癥均有抑制作用［7－8］。重樓和柴胡的活性成分均為皂苷類，《中國藥典》中重樓以重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ為含量測定指標成分，柴胡以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d為指標成分，均采用紫外檢測器，但該類成分只在紫外的末端有吸收，故檢測波長分別設定為203 nm和210 nm。經實驗驗證存在明顯的末端吸收，基線不穩定，且中藥復方制劑的化學成分復雜，在該波長下干擾測定的雜質較多，不適用于復方中皂苷類成分的測定，而蒸發光散射檢測器可彌補這些不足［9］。目前，采用二極管陣列檢測器或液相色譜－質譜聯用技術同時測定重樓藥材中的皂苷類成分已有文獻報道［10－11］，同時測定柴胡藥材中多種皂苷類成分的研究亦有報道［12－13］，但尚無采用超高效液相色譜－蒸發光散射檢測器（UPLC－ELSD）同時測定重樓皂苷和柴胡皂苷的報道。蒸發光散射檢測器在實際應用和操作中比質譜更易于推廣，操作和維護更簡便［14－15］。本文采用蒸發光散射檢測器對復方制劑中5種皂苷類成分進行同時測定，提高了皂苷類成分含量測定的準確性和檢測效率，為重樓消瘤方的質量評價提供了技術支持，為其進一步的深入開發利用奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 儀 器

Agilent 1290超高效液相色譜儀、1260蒸發光散射檢測器（美國Agilent公司）；KQ700－DE型數控超聲波清洗機（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；XS205DU電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 材料與試劑

重樓皂苷Ⅰ（批號：111590－201103，純度92.1%）、重樓皂苷Ⅱ（批號：111591－201103，純度93.4%）、重樓皂苷Ⅶ（批號：11593－201303，純度92.5%）、柴胡皂苷a（批號：110777－201108，純度90.5%）、柴胡皂苷d（批號：11590－201103，純度96.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲醇（分析純，廣州化學試劑廠）；實驗用水為超純水。

10批重樓消瘤方提取物為自制，分別編號為S1 ~ S10。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備溶液：分別取柴胡皂苷a、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷d、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為374.31、443.63、488.06、470.36、355.87 μg/mL的混合標準儲備溶液。

標準工作溶液：吸取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標準儲備溶液0.2、0.5、1、3、5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，混勻，配制成含重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分別為7.117 4 ~ 177.94 μg/mL、9.407 2 ~ 235.18 μg/mL、8.872 6 ~ 221.82 μg/mL、7.486 2 ~ 187.15 μg/mL、9.761 3 ~ 244.03 μg/mL的混合標準工作溶液。

1.4 供試品溶液的制備

取重樓消瘤方提取物約1.0 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，稱定質量，超聲（700 W，50 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

1.5 UPLC－ELSD色譜條件

色譜柱為Waters Cortecs UPLC C18（150 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；流動相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脫：0 ~ 3 min，30% ~ 35% A；3 ~ 9 min，35% ~ 37% A；9 ~ 12 min，37% A；12 ~ 15 min，37% ~ 57%A；15 ~ 20 min，57% ~ 60% A；20 ~ 25 min，60% A；25 ~ 26 min，60% ~ 100% A；26 ~ 31 min，100%A；31 ~ 32 min，100% ~ 30% A；32 ~ 37 min，30% A。流速：0.2 mL/min；柱溫：20 ℃；漂移管溫度：60 ℃；氣體流速：1.5 L/min；增益：2；進樣量：2 μL。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

不同種類、不同極性的有機溶劑對待測組分的提取率影響較大，重樓皂苷和柴胡皂苷均易溶于水、甲醇等溶劑，因此考察了水、甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇作為提取溶劑時的提取效果（見表1）。結果表明，乙醇、70%乙醇對待測成分的提取率較低，70%甲醇次之，水和甲醇的提取率差異較小，但以水為溶劑時待測成分的峰形欠佳，且雜峰較多，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

表1 不同提取溶劑下5種成分的含量測定結果Table 1 Determination results of 5 constituents in different extract solvents w/（mg·g?1）

提取時間對該復方提取物中5種成分的提取亦有影響。分別考察了超聲提取15、30、60 min對5種成分的提取效果，結果顯示，提取15 min時5種成分的提取率較低，提取時間為30 min和60 min的提取率無顯著差異，即超聲提取30 min可將待測組分提取完全。實驗選擇超聲提取時間為30 min。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 檢測器的選擇本實驗曾嘗試采用《中國藥典》中柴胡、重樓項下收載的含量測定方法的色譜條件進行實驗，采用二極管陣列檢測器，檢測波長分別為210 nm和203 nm，發現存在明顯的末端吸收，雜峰較多，嚴重干擾待測組分的分離測定（見圖1）。考慮到柴胡和重樓中的主要有效成分均為皂苷類，故改用蒸發光散射檢測器進行測定，獲得了滿意的分離效果，去除了雜峰干擾，保證了測定結果的準確性。

5種皂苷類成分標準溶液和代表性樣品（S1）的色譜圖見圖2。對比圖1和圖2可見，紫外檢測器在低波長下雜峰較多，除了有流動相的本底吸收，還有一些幾乎無發色團的物質的末端吸收，且吸收較低，干擾較大。而采用蒸發光散射檢測器，流動相已在漂移管中被蒸發，因此基線平穩，留下的揮發性較小的粒子在光的折射下才會被檢出，ELSD可用于檢測不能被紫外吸收的物質，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈敏度相對較低，故含量較低的有紫外吸收的雜質可能在圖譜中未能顯示，且一些揮發性高于流動相的物質同樣會被蒸發而檢測不到。因此，對于同樣的樣品，蒸發光散射檢測器的色譜圖（圖2）與紫外檢測器的色譜圖（圖1）峰數有差異，是由于復方制劑中所含復雜成分的結構性質不同所致。

圖1 重樓消瘤方的UPLC－DAD色譜圖Fig.1 UPLC－DAD spectra of Chonglou Xiaolou Formula

圖2 重樓消瘤方的UPLC－ELSD色譜圖Fig.2 UPLC－ELSD spectra of Chonglou Xiaolou Formula

2.2.2 UPLC－ELSD條件的優化蒸發光散射檢測器以不含鹽、易揮發的溶劑為流動相，故實驗采用C18色譜柱，以乙腈－水為流動相即能對5種皂苷類成分進行較好的分離，經過反復多次實驗，在“1.5”所述的流動相比例下可將雜質和待測成分較好分離。對ELSD的漂移管溫度、噴霧氣體流速、增益系數等參數進行優化，結果發現，在漂移管溫度為60 ℃，噴霧氣體流速為1.5 L/min，增益系數為2，加熱模式下，可獲得高的靈敏度和響應值。優化的色譜檢測條件如“1.5”所示。

2.3 線性關系、檢出限與定量下限

將“1.3”配制的混合標準工作溶液分別按照上述色譜條件進行測定，以待測成分質量濃度的自然對數為橫坐標（X），對應峰面積的自然對數為縱坐標（Y），繪制標準曲線。由表2可知，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的線性關系良好，相關系數（r）為0.999 2 ~ 0.999 8，線性范圍分別為7.117 4 ~ 177.94 μg/mL、9.407 2 ~ 235.18 μg/mL、8.872 6 ~ 221.82 μg/mL、7.486 2 ~187.15 μg/mL、9.761 3 ~ 244.03 μg/mL。分別以信噪比S/N= 3及S/N= 10計算該方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到5種成分的檢出限為0.7 ~ 1.0 μg/mL，定量下限為1.8 ~ 2.4 μg/mL，表明本方法的靈敏度良好。

表2 5種成分的線性關系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relationships，limits of detection and limits of quantitation of 5 components

2.4 精密度

精密吸取供試品溶液（S1）2 μL，注入液相色譜儀中，按“1.5”色譜條件連續進樣6次，計算得到重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.3%、1.5%、1.3%、0.50%、1.8%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性

取同一批提取物（S1），分別于0、2、4、8、12、18 h進樣測定，計算得到上述5種成分峰面積的RSD分別為0.78%、1.2%、1.9%、0.25%、1.8%，表明供試品溶液在18 h內的穩定性良好。

2.6 重復性

取同一批提取物（S1），按“1.3”制備6份供試品，按“1.5”色譜條件依次進樣測定，計算得到上述5種成分峰面積的RSD分別為0.98%、1.7%、1.0%、1.6%、2.1%，表明方法的重復性良好。

2.7 回收率與相對標準偏差

取同一批提取物（S1）約0.5 g，平行處理9份，分別精密加入3個質量濃度的混合對照品溶液10 mL，制備供試品溶液并依次測定。計算得到上述5種成分的平均加標回收率分別為93.9%、103%、102%、104%、105%，RSD分別為3.8%、4.0%、4.2%、3.6%、3.2%（見表3）。

表3 樣品中5種成分的加標回收率及相對標準偏差（n = 9）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of 5 components in samples（n = 9）

2.8 實際樣品檢測

取10批重樓消瘤方提取物，按照本方法制備供試品溶液并進行測定，計算樣品中5種待測物的含量（見表4）。由表4可知，10批自制重樓消瘤方提取物中均檢出重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，含量分別約為0.17 ~ 0.19 mg/g、0.10 ~ 0.12 mg/g、0.35 ~ 0.37 mg/g、1.37 ~1.49 mg/g、0.17 ~ 0.18 mg/g。結果表明該復方提取物的10批樣品之間差異較小，批次間的質量較穩定，說明該方原料質量控制嚴格，制備工藝穩定。

表4 10批樣品中5種成分的含量測定結果（mg/g，n = 3）Table 4 Determination results of 5 constituents in ten batches of samples（mg/g，n = 3）

3 結 論

本文采用超高效液相色譜－蒸發光散射檢測器建立了重樓消瘤方提取物中5種皂苷類成分同時測定的分析方法，可消除紫外檢測器末端吸收的干擾，5種成分的平均回收率為93.9% ~ 105%，相對標準偏差為3.2% ~ 4.2%。將本法用于10批復方制劑樣品的測定，發現批間差異較小。該方法分析快速、操作簡便、準確可靠、靈敏度高，可同時定量分析復方制劑中的5種皂苷類成分，對于重樓消瘤方的質量評價具有指導意義。