基于質譜分析的新精神活性物質代謝研究進展

張桄滕，何洪源，黃家棟，周宗賢

（中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038）

新精神活性物質（New psychoactive substance，NPS）又稱為“策劃藥”、“合法興奮劑”，是繼傳統毒品和合成毒品后的第三代毒品。全球市場上出現的NPS可根據化學結構分為合成大麻素類（例如5FADB、JWH－018）、合成卡西酮類（例如甲氧麻黃酮）、苯乙胺類（例如2C系列化合物）、哌嗪類（例如N-芐基哌嗪）、色胺類（例如賽洛新）、氨基茚滿類（例如2-氨基茚滿）、氯胺酮及苯環利定類（例如4-甲氧基苯環利定）、植物類（例如卡痛、恰特草）和其他類（例如阿片類物質）等。對現有濫用藥物分子進行輕微修飾合成的NPS能夠規避法律監管，以每年幾十種的速度出現在毒品市場上［1］，不僅對吸食者個人的身體健康造成損害，還極易引發關聯的違法犯罪甚至嚴重的社會問題，不利于經濟發展和社會穩定。

NPS在人體內代謝迅速，尿液和血液中母體化合物的濃度將在短時間內下降，通過分析代謝產物可有效延長NPS的檢測窗口期，對毛發、血液或尿液等生物樣品的檢測十分重要［2］。為了解NPS的代謝研究現狀，在Web of science核心合集中，以檢索式“（（TS=（new psychoactive substance）） OR TS=（novel psychoactive substance）） AND PY=（2011－2022）”進行檢索（2022年10月20日），使用關鍵詞“metabolite”，“metabolism”或“metabolic”對檢索結果進行篩選，去重后整理得到786篇相關文獻。結果顯示，隨著NPS的濫用問題日益嚴重，自2011年以來，NPS代謝相關的研究年度發文量呈上升趨勢，2017年已超過80篇，見圖1A。使用文獻計量分析軟件Vosviewer［3］對2017 ~ 2022年發表的相關文獻進行分析，顯示頻次大于15的關鍵詞，合并、清洗后得到125個共現關鍵詞，繪制共現關鍵詞密度圖，見圖1B。

圖1 年度發文量趨勢圖（A）和共現關鍵詞密度圖（B）Fig.1 Trend chart of annual publications（A） and density visualization of co-occurrence keywords（B）

共現關鍵詞密度圖能夠在一定程度上反映相關領域的研究熱點。關鍵詞在文獻中出現的頻次越高，在密度圖中對應節點的顏色越深。在圖1B中，“metabolite”、“mass spectrometry”及其相鄰節點顏色較深，表明NPS代謝物的確定是該領域的研究熱點，質譜法是常用的儀器分析方法。

質譜分析技術能夠得到未知化合物的分子量和子離子信息，準確性好、靈敏度高、適用范圍廣，是目前鑒定NPS及其代謝產物結構的主要分析方法。真實的人體數據是代謝物鑒定的金標準，但由于臨床安全性不明和倫理問題，來自人體的樣本難以獲得，可控的人體研究也無法進行。目前關于人體的代謝研究主要采用與人體代謝相似的體內、體外代謝模型以及代謝預測軟件［4－5］等工具進行。本文介紹了除人體以外主要的體內、體外代謝模型，總結了不同模型的適用性和優缺點，綜述了近5年報道的基于質譜分析的NPS體內、體外代謝研究，并與已知的人體數據進行了討論和比較，展望了代謝研究的發展趨勢，以期為NPS藥代動力學及毒理學等相關研究提供有益參考。

1 NPS體外代謝研究

NPS體外代謝使用的代謝模型主要有：重組人源同工酶、肝細胞、肝微粒體、肝S9、肝癌細胞系以及真菌等。細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶（UGT）是人體內代謝反應的主要催化酶，一些研究［6－10］使用重組人源CYP或UGT同工酶的單酶孵育來確定代謝產物和相應的催化酶。由于代謝環境與人體最為相似，原代人肝細胞（PHH）被認為是模擬人體代謝的良好工具。但人肝細胞在體外需要冷凍保存，成本高、易失活且代謝酶表達不穩定。人肝微粒體（HLM）和人肝S9（HLS9）的體外孵育是研究NPS代謝的成熟方法，與PHH相比成本更低、耗時更短。為了減少代謝酶表達水平個體差異的影響，代謝研究選用的PHH、HLM或HLS9應為來自多個供體的混合制品。此外，從肝臟人源化的嵌合體小鼠中分離的肝細胞（PXB-cells）也被用于體外代謝研究［11－12］，但這種方法成本較高，還存在約10%的鼠肝細胞污染［13］。微生物模型能夠表達大多數Ⅰ相代謝同工酶，已經成為藥物代謝研究中的補充工具［14］，但Ⅱ相代謝酶與人體存在一些差異。

1.1 重組同工酶：CYP與UGT

藥物在體內的代謝主要有兩個過程，即由單加氧酶CYP催化的Ⅰ相代謝反應和UGT為主要代謝酶的Ⅱ相代謝反應。二者是并存關系，含有羥基的母體化合物或Ⅰ相代謝產物可以在UGT的催化下與輔因子中的葡萄糖醛酸基結合。通過代謝反應，藥物分子的水溶性增強，利于排出體外。

Wagmann等［9－10］以10種CYP或FMO3同工酶和13種UGT同工酶對3種苯二氮卓類藥物進行單酶孵育，采用液相色譜－高分辨串聯質譜（LC－HRMS/MS）鑒定代謝物，并給出了催化Ⅰ相或Ⅱ相代謝反應的同工酶譜。Bergstrand等［6］通過13種UGT同工酶的體外孵育，在9種苯二氮卓類策劃藥中檢測到7種母體的葡萄糖醛酸結合物，確定UGT1A4是Ⅱ相代謝反應主要的催化同工酶。

1.2 人肝細胞

從生物體內分離得到的肝細胞包含代謝所需的全部Ⅰ/Ⅱ相代謝酶、輔因子、藥物轉運蛋白以及結合蛋白。Fabregat－Safont等［15］首次研究了吲哚卡西酮的代謝情況，采用PHH模型對3種合成卡西酮（4-CEC、4-CPRC和5-PPDI）以及1種苯丙胺（3-FEA）進行體外孵育，采用超高效液相色譜－高分辨質譜（UHPLC－HRMS）鑒定了5-PPDI的12種Ⅰ相代謝物、4-CPRC的2種次要代謝產物，4-CEC和3-FEA未被代謝。Kim等［16］通過混合人肝細胞孵育和液相色譜－高分辨質譜（LC－HRMS）檢測表征了苯乙胺類策劃藥25B－NBF的體外代謝情況。結果表明，CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9和CYP2C19等參與了25B－NBF的羥基化、O-去甲基化等反應，UGT2B7在25B－NBF的葡萄糖醛酸化反應中起重要作用。

1.3 人肝微粒體及人肝S9

通過差速離心法可以從組織勻漿中得到微粒體。肝微粒體含有的代謝酶主要是催化Ⅰ相反應的CYP。Seo等［17］采用HLM研究了25N－NBOMe的體外代謝情況，并用液相色譜－四極桿飛行時間質譜（LC－QTOF MS）對代謝產物進行了結構表征。25N－NBOMe在HLM中的生物轉化包括羥基化、O-脫甲基化、N-脫烷基化、硝基還原、脫氫、羰基化及其組合，羥基化產物是最豐富的Ⅰ相代謝物。

S9是將組織勻漿9 000 g離心后得到的上清液。肝S9含有肝的重要酶系，其中包括負責藥物代謝的CYP等單加氧酶、葡萄糖醛酸轉移酶、硫酸轉移酶以及一些脫氫酶和氧化酶等。Caspar等［18］采用混合人肝S9（pHLS9）模型和大鼠模型對4-EA－NBOMe進行了代謝表征，在pHLS9體外模型中鑒定了13種Ⅰ相代謝物和5種Ⅱ相代謝物，低于大鼠尿液中的代謝物數量，可能是物種差異和大鼠代謝時間長所致，但4-EA－NBOMe在兩種模型中的O-脫甲基化、O-脫甲氧基芐基化、羥基化和氧化等代謝途徑相似。

1.4 人肝癌細胞系：HepG2及HepaRG

作為PHH的替代工具，人肝癌細胞系生存期長、細胞穩定性好、易獲得，擁有與PHH相似的代謝酶族及轉運蛋白。HepG2細胞是來自人肝癌組織的永生細胞系，成本低、易處理，但一些Ⅰ相代謝酶的表達水平較低。HepaRG細胞系是2002年Gripon等［19］首次從慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌女性患者體內的非瘤組織中分離出來的細胞株，在一定條件下可分化為肝細胞形態和膽管樣結構，與PHH相似且代謝酶活性更高。研究表明，HepG2和HepaRG細胞是代謝研究中替代人肝細胞的合適模型。

Richter等［20］研究和比較了8種NPS的代謝物（6種亞甲二氧甲基苯丙胺衍生物和2種生物類似物）在HLM與細胞質基質（pHLM/pHLC）、pHLS9、HepG2和HepaRG細胞模型中的代謝情況。結果表明，在代謝產物總數和豐度方面，HepaRG細胞孵育的結果優于HepG2細胞，HepaRG細胞模型生成的代謝物比pHLM/pHLC或pHLS9略多。Richeval等［21］采用LC－HRMS在HepaRG細胞孵育中確定了呋喃芬太尼Fu－F在pHLM孵育中的所有代謝物以及另外9種次要代謝物。

1.5 真菌：小克銀漢霉（Cunninghamella）

小克銀漢霉菌屬的真菌具有與人體類似的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶，短刺小克銀漢霉、雅致小克銀漢霉（C. elegans）和刺孢小克銀漢霉等菌株常被應用于藥物代謝研究中［14］。與肝癌細胞系相比，微生物模型成本低、方便處理，但存在孵育時間長、實驗要求高且代謝酶與人體差異較大等缺點，可以作為體外代謝研究的補充模型。根據Watanabe等［22－23］和Leong等［24］的研究，在雅致小克銀漢霉孵育中能夠鑒定出5F－PB－22、PB－22、XLR－11、UR－144、AM1220和4F－MDMB－BINACA 6種合成大麻素的Ⅰ相和Ⅱ相代謝物，但Grafinger等［25］在雅致小克銀漢霉孵育中卻未能檢測到二甲基色胺（DMT）、N-乙基-4-羥基-N-甲基色胺（4-HO－MET）、N，N-二烯丙基-5-甲氧基色胺（5-MeO－DALT）和5-甲氧基-N，N-二異丙基色胺（5-MeO－MiPT）4種合成色胺類物質的Ⅱ相代謝物，這可能是由于使用了不同的菌株所致。

表1總結了近5年主要NPS體外代謝研究的代謝模型和實驗條件。

表1 主要NPS體外代謝研究Table 1 Summary of selected studies using in vitro models for studying the metabolism of NPS

2 NPS體內代謝研究

NPS體內代謝研究使用的代謝模型主要有：小鼠、肝臟人源化小鼠、大鼠、豬和斑馬魚等。嚙齒類動物是最常用的研究工具，通常在確定的時間段內收集鼠的尿液，以檢測不同時期的排泄物。小鼠具有與人類相似的基因，是醫學研究常用的模式生物。大鼠和豬體型較大，能夠為藥代動力學分析提供足夠的樣本，從而允許高通量的藥物篩選。為了減少物種差異而開發和應用的肝臟人源化動物模型及相關技術也在不斷發展。除了哺乳動物，斑馬魚（Danio rerio）體內模型在代謝研究中逐漸被廣泛應用，在歐盟等國家和地區，使用受精后120 h內的斑馬魚幼體的動物實驗不需要倫理審查，但存在與人親緣關系遠、給藥途徑差異大等缺點。

2.1 小鼠、肝臟人源化小鼠

小鼠與人類間存在大量的同源基因，是培育品系最多的實驗動物，作為藥物篩選、遺傳工程、病理研究的動物模型被廣泛應用。Carrola等［32］通過腹腔注射單次給藥小鼠，采用高效液相色譜－串聯質譜（HPLC－MS/MS）首次對鼠尿中的兩種合成卡西酮NEH、BUPH及其Ⅰ相代謝物進行了定性和定量研究，并首次檢測到非環取代合成卡西酮的4-芳基羥基代謝物，兩種藥物的代謝途徑與其它N-烷基化卡西酮相同，最主要的Ⅰ相代謝物β-酮-N-脫烷基化合物已被建議作為人體藥物暴露的尿液生物標志物［33］。作者使用超高效液相色譜－靜電場軌道離子阱高分辨質譜（UPLC－Orbitrap HRMS）在小鼠尿液中初步確定了各種Ⅱ相代謝物，包括N-乙酰化物、葡萄糖醛酸和二羧酸結合物。

用人肝細胞替換小鼠的肝細胞，可以得到擁有人源化肝臟的嵌合體小鼠，肝臟人源化小鼠示意圖見圖2。人源化肝臟與人類肝細胞的酶學特征十分相似，因此嵌合體小鼠具有更低的物種差異性，成為藥代動力學研究有吸引力的動物模型［34］。嵌合體小鼠的肝細胞也被用于體外代謝研究［11］。但人源化技術成本高、操作復雜，嵌合體小鼠體內仍然存在的鼠肝細胞和藥物在體內的廣泛代謝使物種差異仍然存在。

圖2 肝臟人源化小鼠示意圖［13］Fig.2 Schematic diagram of liver-humanized mice［13］

Luo等［13］總結了肝臟人源化小鼠的特征，Naritomi等［34］討論了肝臟人源化小鼠預測藥物代謝和藥代動力學的現狀、問題和發展方向。目前沒有發現近5年使用肝臟人源化小鼠模型的體內代謝研究。

2.2 大 鼠

大鼠的體型一般是小鼠的十倍以上，易于采樣和藥物代謝動態監控，生理功能與人類更相似，且價格低、操作簡單，是體內代謝研究常用的哺乳動物模型。Wagmann等［35］采用LC－HRMS/MS分析口服給藥后的大鼠尿液和pHLS9孵育產物，研究了3種2C系列化合物2C－E－FLY、2C－EF－FLY和2C－T－7－FLY的代謝情況。初步鑒定出32種代謝產物，主要代謝步驟為羥基化和N-乙酰化。同時采用基于氣相色譜－質譜（GC－MS）、液相色譜－串聯質譜（LC－MSn）和LC－HRMS/MS的標準尿液篩查方法進行同工酶活性篩選，確定了催化各代謝反應的同工酶。

特定物種肝臟的完整特征無法在任何其他物種中完全概括，這使物種的新陳代謝具有特異性。一些研究報道的嵌合體小鼠的人肝細胞嵌合率（Replacement index > 90%）令人滿意［36］，但體型和病理學差異等因素限制了該模型的應用。于是，人們積極開發體型較大的人源化動物模型，例如大鼠、豬等。Zhang等［37］構建了重度免疫缺陷的FAG大鼠，進行確保存活的肝損傷預處理后，將PHH移植到FAG大鼠體內進行可持續增殖，7個月后嵌合率達到30%。該研究開發的預處理方法能夠為其他大型物種的人肝細胞移植提供參考，得到的肝臟人源化大鼠具有人肝特有的體內代謝特征，能夠為藥代動力學研究提供新的工具。

基因編輯技術CRISPR－Cas9獲得了2020年諾貝爾化學獎，這種超選擇性的精確基因編輯工具簡單、高效，可用于建立藥物代謝和藥代動力學（DMPK）的大鼠模型，如Cyp、Abcb1、Oatp1b2基因敲除大鼠。Lu等［38］總結了利用CRISPR－Cas9建立DMPK大鼠模型的方法，預計該技術有望推動建立新的動物模型和發現藥代動力學領域的新成果。

2.3 豬

豬與人的體內代謝具有相似性，且大型實驗動物可提供的樣本量大、允許多種給藥途徑，是研究體內代謝的理想模型。Schaefer等［39－40］使用超聲波霧化器對豬進行肺部給藥后，采用HPLC－MS/MS檢測了2種合成大麻素JWH－210、RCS－4和四氫大麻酚（THC）及其代謝物在不同器官和組織的分布情況。結果表明，腎臟和肺部組織是JWH－210死后分析的可行基質，肺部組織是檢測RCS－4的合適基質，肝組織、膽汁液以及十二指腸內容物是檢測THC的合適基質，膽汁和十二指腸內容物是最適合定量分析代謝物的樣本。Doerr等［41］將5F－MDMB－P7AICA原液霧化后使豬吸入，采用LC－HRMS/MS分析豬尿中的代謝產物，并與豬肝微粒體孵育、人肝微粒體孵育以及文獻［42－43］報道的其他體內外模型的代謝結果進行比較，結果在豬尿中鑒定了9種I相代謝物和3種Ⅱ相代謝物，并推薦酯水解產物、酯水解+葡萄糖醛酸結合產物和酯水解+羥基化產物作為尿液篩查的目標物。該研究使用豬模型得到的代謝結果與已知的人體數據一致。

2.4 斑馬魚、斑馬魚幼體

斑馬魚是一種生活在淡水中的小型硬骨魚，最早于20世紀80年代初作為模型動物被Streisinger等［44］應用在遺傳學研究中。斑馬魚與人類基因的同源性高達87%，其體內的幾種代謝酶在人體內有直系同源物，且體型小、發育快、養殖成本低、繁殖率高，成為一種新興的代謝模型［45－46］，也被用于NPS毒理學的研究［47－49］。斑馬魚幼體與成年斑馬魚的代謝存在差異，成年斑馬魚與人體代謝的相似性更高［50－51］。

斑馬魚并非哺乳動物，為了評估其模擬代謝的能力，Pesavento等［52］采用斑馬魚幼體模型和小鼠模型研究了芬太尼的體內代謝情況。通過LC－HRMS分析斑馬魚幼體提取物和小鼠尿液，發現芬太尼在兩種模型中的代謝特征相似，代謝途徑主要包括羥基化、N-氧化和N-脫苯乙基化，去苯乙基芬太尼是最主要的代謝產物。Gampfer等［53］采用LC－HRMS/MS在pHLS9孵育中確定了兩種芬太尼類似物4FCy－BAP和Fu－BAP的Ⅰ相和Ⅱ相代謝物，其中大部分在斑馬魚幼體中也能檢測到。相比體外模型，斑馬魚或斑馬魚幼體可以被用來觀察藥物在體內的分布、吸收和排泄等藥代動力學過程或毒理學數據，代謝特征也與成熟的嚙齒類動物模型相似，逐漸被用于NPS的體內代謝研究中。

近年來，許多學者開始研究合成大麻素類NPS在斑馬魚體內的代謝情況［43，54－58］。Richter等［43］通過在培養基中添加或顯微注射卵黃囊使斑馬魚幼體暴露于合成大麻素7′N－5F－ADB，結果在顯微注射卵黃囊的幼體中只發現了少量的代謝產物，而通過培養基給藥然后對幼體進行分析得到的代謝特征與體外模型的代謝結果相似，是合適的實驗方法。Park等［54］進一步考察了采用水體暴露、顯微注射不同部位（卵黃囊、尾靜脈、心室、后腦）等給藥途徑時，合成大麻素7′N－5F－ADB在斑馬魚幼體模型中代謝特征的差異，并將結果與文獻報道的HepaRG細胞孵育結果［43］和真實人尿樣本數據［42］進行比較，結果見表2。在顯微注射的斑馬魚幼體中共發現24種代謝物，其中19種也出現在人尿樣本（27種）中，匹配率高達70%，表明該方法效果良好。不同的給藥途徑影響藥物在斑馬魚體內的分布等藥代動力學過程和代謝特征，注射到心室等重要器官有助于親脂性NPS在體內的分布和代謝，開展研究工作時應根據實際需要選擇合適的給藥途徑。

表2 7′N－5F－ADB在不同模型中的代謝情況Table 2 Summary of 7′N－5F－ADB and its metabolites in the different models

Wagmann等［8］比較了幾類NPS在pHLS9、HepaRG細胞和斑馬魚幼體模型中的代謝情況。結果表明，斑馬魚幼體實驗與人類血漿和尿液分析中得到的數據最吻合。目前的研究表明，斑馬魚或斑馬魚幼體是表征NPS代謝情況的一個很有前途的模式生物。

表3總結了近5年主要NPS體內代謝研究的代謝模型和實驗條件。

表3 主要NPS體內代謝研究Table 3 Summary of selected studies using in vivo models for studying the metabolism of NPS

3 與真實人體樣本數據的比較

由于代謝酶表達不同和物種差異性等原因，利用人體以外的代謝模型獲得的代謝物豐度信息并不關鍵。進行代謝研究是為了通過分析人體生物樣本來檢測NPS的攝入量，因此代謝物色譜和質譜信息對NPS的尿液篩查十分重要。為了評估體外和體內模型對預測人類生物樣本中NPS生物標志物的適用性，應將在代謝模型中檢測到的代謝物與人類生物樣本中的推薦篩選目標進行比較。對于細胞系統，通常HepG2細胞的代謝特征與人類數據的相似程度最小［20，24］。真菌C. elegans生成的代謝物與人類生物標志物表現出良好的一致性［22，24］。

一些研究比較了不同代謝模型與人體內合成大麻素5F－MDMB－P7AICA的代謝情況［41－43，54］。對于人尿樣本中確定的6種豐度最高的人體代謝物［42］，Richter等［43］在pHLS9模型中檢測到其中3種，在斑馬魚幼體模型中檢測到4種，在HepaRG細胞模型中檢測到5種，斑馬魚幼體和HepaRG細胞孵育提供了最全面的人類尿液代謝譜。Doerr等［41］將他們基于豬模型發現的代謝物與人體代謝物進行了比較，并描述了豬尿中類似的代謝物模式。Park等［54］發現顯微注射的斑馬魚幼體產生的代謝物與人體代謝物的吻合率高達70%。

Nordmeier等［60］在豬模型中表征的合成阿片類藥物U－47700的代謝情況與人體數據相似。Yue等［55］在斑馬魚模型中鑒定了合成大麻素4F－MDMB－BICA的代謝產物，其中12種已在人體樣本中被發現，最豐富的酯水解代謝物被認為是確定4F－MDMB－BICA人體攝入的可靠生物標志物［62］。Wohlfarth等［63］發現苯二氮卓類藥物Flubromazolam在人肝細胞體外孵育中不能進行廣泛的代謝，僅產生少量代謝物，而大鼠體內模型中發現的7種代謝產物大部分可在人體樣本中找到。

生理藥代動力學（PBPK）模型是通過將人體器官視為獨立的隔室，根據生理學和解剖學知識將其整合成一個系統來研究藥物的藥代動力學。與傳統的房室模型相比，PBPK模型的房室和參數更具生理學意義，能夠更準確地反映藥物在體內的藥代動力學過程［64－65］。文獻報道了PBPK模型在預測特殊人群的NPS攝入［66－68］、NPS血腦濃度－時間變化［69］和藥物相互作用［70］等方面的應用。PBPK模型具有強大的外推能力，可通過納入代謝模型與人體的藥物代謝酶、代謝酶貢獻和藥代動力學參數等信息，進行單種屬或多種屬外推，有潛力成為準確推斷NPS在人體內代謝途徑、代謝物和生物標志物的可靠工具。

4 總結與展望

一般而言，體外模型操作方便、孵育快速、對設備和人員要求不高，但存在活性有限、代謝酶表達不穩定等缺點；體內模型能夠提供多種給藥途徑、允許監測藥物在體內的分布等藥代動力學過程，但對養殖、實驗操作要求高，與人類的物種差異性難以解決。不同代謝模型在實驗成本、實驗操作和酶學特征等方面各有優缺點，應根據具體藥物、研究需要等選擇合適的代謝模型。

全球的毒品形勢不容樂觀，新的NPS在市場上不斷出現，而相關化合物性質和人體數據難以獲得，因此迫切需要通過代謝模型對各類NPS及其主要代謝物進行全面系統的研究，從而更加全面地評估NPS的代謝途徑，推斷人體攝入的生物標志物。同時，考慮到藥物在體內的廣泛代謝，還應利用體內代謝模型研究NPS在體內的吸收、分布或排泄等藥代動力學過程。此外，大型實驗動物的肝臟人源化技術、基于微流控技術的芯片器官以及PBPK模型等新方法的發展可能會為NPS的代謝研究提供新思路。