陸源DON親水和疏水組分對米氏凱倫藻和中肋骨條藻生長及種間競爭的影響?

馬旭紅，張艷紅，李 敏，李克強

(中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

近年來，隨著全球近岸海域富營養化程度的不斷加劇，致使有害赤潮頻發多發，嚴重危害海洋生態健康[1-4]。2002—2017年間，中國近海共發生赤潮1 177次, 其中東海區、南海區、渤海區和黃海區分別發生赤潮718、202、133和124次；涉及海域面積161 526 km2，其中東海區、渤海區、黃海區和南海區分別有103 776，34 729，13 302和9 719 km2海域受到影響[5]。近40年間渤海灣赤潮的肇事種主要有夜光藻(Noctilucascintillans)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、叉角藻(Ceratiumfurca)、球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)、米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)和紅色中縊蟲(MesodiniumRubrum)[6]。近20年間福建沿海赤潮主要發生在每年4-7月，高發期為5-6月，主要赤潮種為東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、夜光藻(Noctilucascintillans)、中肋骨條藻(S.costatum)、角毛藻(Chaetocerossp.)和米氏凱倫藻(K.mikimotoi)，以甲藻類赤潮為主；甲藻類赤潮多為災害性赤潮，造成直接經濟損失最多的是米氏凱倫藻赤潮[7]。2012年在福建沿海發生了以米氏凱倫藻為優勢藻種的有毒赤潮，致使大量養殖鮑死亡，直接經濟損失累計超過20億元，這是我國近海赤潮造成經濟損失最嚴重的記錄[8-9]。

大量研究表明，人類活動引起的氮、磷負荷增加是導致近海富營養化的主要原因[10-12]。近年來，近岸海域溶解有機氮濃度及其在總氮中的占比逐漸升高，對浮游植物的氮營養貢獻愈來愈受到重視[13-16]。DON被認為是細菌、真菌以及浮游植物的潛在氮源[17-18]。傳統上，DON被認為是一種難利用的有機氮源，對浮游植物的生物可利用性低，但有些浮游植物(如微小原甲藻、米氏凱倫藻等)，在低無機氮環境中能利用DON，從而具有競爭優勢[19-20]。有研究表明，約10%～72%的DON可作為浮游植物氮源，直接參與生物氮循環過程，并促進浮游植物生長[15,21-25]。然而由于DON的結構組成極為復雜，其對浮游植物生長影響作用的認知還十分有限[26]。DON的生物可利用性，包括易降解、半易降解和難降解組分，由DON化學結構決定，并受其來源、成分和分子大小的影響[27-29]。例如，一些親水性低分子量的DON，如尿素、溶解態蛋白質、溶解結合態氨基酸(DCAAs)和溶解游離態氨基酸(DFAAs)，可以被許多浮游植物利用，支撐淡水和海洋系統中的大部分浮游植物的生長[30-32]，這些DON中基于蛋白質的親水組分是易被浮游植物利用的氮源[23,33]。

DON的降解利用需要氨基酸氧化酶、亮氨酸氨肽酶、肽酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等多種酶的協作，其中，亮氨酸氨肽酶是研究最多的，它的酶活性可以用來指示DON的利用水平[33-35]。亮氨酸氨肽酶是一種肽鏈內切酶，可以水解多肽或蛋白質的肽鍵形成小分子的肽或氨基酸供浮游植物利用，主要以顆粒態而不是游離態或溶解態形式表達[37-39]。

目前，國內外大多數研究主要集中在無機氮或者小分子溶解有機氮(主要是氨基酸和尿素)與浮游植物生長之間的關系，而對于浮游植物與不同組分溶解有機氮之間關系的認知還十分有限，且存在頗多爭議。為此，本研究選取我國近海主要赤潮肇事種米氏凱倫藻和中肋骨條藻，以畜禽養殖源有機質為DON氮源，通過單一藻和雙藻混合室內受控加富培養實驗，從動力學上初步探討了兩種藻對DON親水和疏水組分的響應。研究結果有助于了解人為來源有機氮對赤潮藻生長及其種間競爭的影響，并可為赤潮的預測和防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和處理

據第二次全國污染源普查公報，畜禽養殖源是近岸海域陸源污染的主要來源，占農業源總氮排放量約42%[40]。因此本文選擇畜禽養殖源作為陸源DON，DON水樣獲取的具體操作步驟：取雞糞10 g，溶于1 L的60℃的超純水，搖動，放置24 h之后再離心15 min(7 000 r·min)，之后用0.22 μm的聚碳酸酯濾膜過濾得到。水樣中的DON濃度約為7 873 μmol·L-1、NH4-N濃度約為1 841 μmol·L-1、PO4-P 濃度約為452 μmol·L-1(見表1)。陸源DON親水性和疏水性組分采用XAD-8樹脂分離獲取，DON回收率約為74%。具體操作步驟：(1)預處理：將300 g樹脂用0.1 mol·L-1NaOH溶液浸泡24 h，傾倒上層液體和破碎顆粒，重復3次，然后將樹脂用甲醛沖洗3次；(2)前處理：將樹脂裝入色譜柱中，依次用Milli-Q水，0.1 mol·L-1NaOH溶液和0.1 mol·L-1HCl溶液反復沖洗，這個過程重復到流出液的溶解有機碳濃度低于0.2 mg·L-1方可使用；(3)樣品分離：將2 L畜禽養殖源水樣用鹽酸酸化至pH為2，以1 mL·min-1的流速通過裝有XAD-8樹脂的色譜柱，流出的水樣繼續用鹽酸酸化至pH為2，接著以流速1 mL·min-1再次通過色譜柱，收集得到親水組分，接著用2倍柱體積的0.01 mol·L-1HCl溶液沖洗色譜柱，最后用2倍柱體積的0.01 mol·L-1NaOH溶液以流速1 mL·min-1反沖洗色譜柱，收集得到疏水組分，經萃取和洗脫操作，疏水組分濃縮了3.3倍。分離結束后，重復前處理過程回收樹脂。經處理后，DON親水組分和疏水組分水樣中的DON濃度分別約為3 848和1 983 μmol·L-1、NH4-N濃度分別約為1 268和181 μmol·L-1、PO4-P 濃度分別約為942和128 μmol·L-1(見表1)。

表1 畜禽養殖源水樣各組分營養鹽濃度

1.2 培養實驗

培養實驗所用米氏凱倫藻和中肋骨條藻接種于中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室藻種室，培養實驗所用陳化海水取自黃海沙子口臨近海域(36°06′N，120°30′E)。將培養實驗所用陳化海水使用0.45 μm的醋酸纖維膜過濾除去顆粒物，在將過濾海水在121 ℃下高溫高壓滅菌30 min除去海水中細菌。

為探究DON的不同組分對米氏凱倫藻和中肋骨條藻生長的影響，分別設置了米氏凱倫藻單一藻培養組、中肋骨條藻單一藻培養組、米氏凱倫藻和中肋骨條藻混合藻培養組。每個培養組又進一步分別設置添加了DON原水組分、DON親水組分和DON疏水組分，每組設置3個平行。實驗采用5 L滅菌錐形瓶進行培養，向各培養體系中都先依次加入3.5 L滅菌海水，之后向各培養體系加入藻種，將100 mL米氏凱倫藻和100 mL中肋骨條藻分別加入相應培養體系，在混合藻培養體系分別加入50 mL米氏凱倫藻和50 mL中肋骨條藻藻種(藻個數比為1∶1)。加入畜禽養殖源相應組分的DON，其中DON原水組、DON親水組、DON疏水組加入的DON源體積分別為25、50和30 mL。將與畜禽養殖源水樣所含等量DIN(NO3-N和NH4-N；國藥集團化學試劑有限公司)添加的培養體系作為對照組。此外本文添加了PO4-P(KH2PO4；國藥集團化學試劑有限公司)，維生素和微量元素(國藥集團化學試劑有限公司)。各培養體系最終的培養條件見表2。將錐形瓶搖勻并置于培養箱中，設置光照強度191 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h∶12 h，溫度為(20±1)℃。米氏凱倫藻的培養周期為22 d，中肋骨條藻的培養周期為10 d，雙藻混合培養周期為10 d，取樣頻次為2天1次，取樣前將培養體系搖勻。取300 mL藻液，將未經過濾的藻液，迅速裝入10 mL棕色離心管，放入液氮中冷凍保存，用來測定亮氨酸氨肽酶活性。將剩余取出的藻液經0.7 μm的GF/F玻璃纖維膜(Whatman公司，450 ℃下灼燒4 h)過濾，濾膜用于測定葉綠素和PN，將濾液分別裝入多個10 mL的離心管和30 mL棕色瓶中，并將樣品置于-20 ℃的冰箱中，用于測定水體的TDN、DIN、TDP、DIP。

表2 培養實驗條件

1.3 分析方法

TDN采用總碳/總氮自動分析儀(Multi N/C 3100; Analytik Jena AG, Jena, Germany)高溫催化氧化法測定[41]。DIN(NH4-N，NO3-N和NO2-N)使用營養鹽自動分析儀(AAⅢ; Bran+Luebe, Norderstedt, Germany)測定。TDN和DON差減得到DON(DON=TDN-DIN；總溶解磷(TDP)和顆粒氮(PN)采用《海洋調查規范》的堿性過硫酸鉀氧化法測定。亮氨酸氨肽酶的測定是通過測定亮氨酸氨肽酶對底物L-亮氨酸-7-氨基-甲基香豆素鹽酸鹽(L-leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride)的水解速率獲得，將樣品自然解凍，加底物L-亮氨酸-7-氨基-甲基香豆素鹽酸鹽(濃度為120 μmol·L-1)后放在35 ℃水浴下避光反應2 h，使用Fluorolog3-11熒光分光光度計(Jobin Yvon, France)測定，設定激發波長Ex為380 nm，發射波長Em為440 nm，測定熒光值[42]。葉綠素的含量采用90%的丙酮在低溫4 ℃下萃取24 h，離心10 min后取上清液，然后用分光光度法測定吸光度[43]。

1.4 數據處理方法

1.4.1 浮游植物生長擬合方程 通過Origin軟件(The Microcal Inc.)擬合浮游植物的生長曲線，選取Slogistic2生長模型擬合浮游植物的終止生物量和最大吸收速率，公式如下[44]：

(1)

式中：Bt為t時刻的生物量(Chla，μg·L-1)；Bf為終止生物量(Chla，μg·L-1)；B0為初始生物量(Chla，μg·L-1)；4μmax/Bf為最大生長速率(d-1)。

1.4.2 浮游植物生長氮吸收擬合方程 浮游植物對氮吸收的動力學方程一般采用Monod方程[45]，根據同時考慮浮游植物生長和衰亡過程和整個過程中N守恒，數學模型擬合時以PN代表計算浮游植物生物量，對數學模型方程進行修訂[46]。

其中，針對在NO3和NH4條件下的非線性微分方程為：

(2)

(3)

(4)

針對DON和DIN同時吸收條件下的非線性微分方程為:

(5)

(6)

(7)

式中:NO3，NH4，DIN，和DON代表不同氮營養鹽的濃度(μmol·L-1);PN：以氮衡量的浮游植物生物量(μmol·L-1);kup：營養鹽吸收速率(h-1);ks NO3，ks NH4，ks DIN和ks DON：半飽和常數(μmol·L-1); NH4in：氨氮限制因子;DNmin(NO3min，NH4min，DINmin和 DONmin)為氮的最小濃度閾值(μmol·L-1);kG：浮游植物生長速率(h-1)。

非線性擬合程序應用MATLAB(R2016b，MathWorksR)軟件開發，算法采用ode45函數，根據最小二乘法擬合動力學參數。

使用單因素分析法進行顯著性檢驗，顯著性水平設置為α=0.05。使用Windows19.0版本的IBM SPSS分析(IBM Corp., Armonk, NY, USA)。

2 結果與討論

2.1 浮游植物生長

以Chla濃度表征浮游植物生物量，米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長均符合“S”型生長曲線，生長階段符合Slogistic2生長模型。其中，米氏凱倫藻用了約12天由遲緩期進入指數生長期，約22天到達平臺期；而中肋骨條藻僅用了1天就進入指數生長期，4天達到平臺期，之后迅速進入死亡。米氏凱倫藻和中肋骨條藻混合藻培養實驗中，中肋骨條藻在2天后成為優勢種，其生長曲線與中肋骨條藻單一藻培養的生長曲線在趨勢上基本一致(見圖1)。在DON親水性組分加富培養下，兩種藻的生長曲線均快于DON疏水性組分加富培養，除米氏凱倫藻中DON疏水性加富組外，其他實驗組的DON均能顯著促進浮游植物生長(見圖1)。

(紅色線是添加DON親水組分; 黑色線是添加DON原水組分; 藍色線是添加DON疏水組分; 紫色線是對照組。Red lines are add to hydrophilic components; Black lines are add to terrestrial aquaculture source; Blue lines are add to hydrophobic components; Purple lines are control groups.)

本研究中中肋骨條藻(S.costatum)各實驗組的終止生物量和最大生長速率均大于米氏凱倫藻(K.mikimotoi)各實驗組的終止生物量和最大生長速率(見表3)。添加親水DON實驗組比添加疏水DON實驗組更能促進浮游植物的生長，表現在米氏凱倫藻添加親水DON實驗組的終止生物量((115.38±11.09)μg·L-1)和最大生長速率((0.52±0.066)d-1)均大于添加疏水DON實驗組的終止生物量((87.65±6.18)μg·L-1)和最大生長速率((0.50±0.023)d-1)；中肋骨條藻添加親水DON實驗組的終止生物量((192.92±6.50)μg·L-1)和最大生長速率((2.34±0.18)d-1)均大于添加疏水DON實驗組的終止生物量((149.08±5.36)μg·L-1)和最大生長速率((2.20±0.17)d-1)(見表3)。有研究表明，來自湖泊沉積物[47-49]和污水處理廠出水口DON[50-51]的親水組分能被浮游植物吸收利用，刺激浮游植物的生長，而污水處理廠排放廢水中的DON疏水性組分，即使在細菌存在的情況下，在數周內也不能被浮游植物利用[52]。但也有研究表明，并不是所有的DON疏水性組分都不能被利用，如來自農場及農田附近的DON疏水性組分有較高生物可利用性，可以被浮游植物吸收利用并促進浮游植物的生長[53]。

表3 DON不同組分加富培養下，米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長動力學參數

2.2 營養鹽吸收過程

在浮游植物生長期間，米氏凱倫藻和中肋骨條藻各DON加富實驗組的氮營養鹽濃度都發生變化，其中NH4-N、NO3-N和DON的濃度下降，PN的濃度會隨著浮游植物的生長逐漸積累增加，與葉綠素的變化趨勢一致(見圖2)。結果顯示，中肋骨條藻單獨培養下，NH4-N、NO3-N和DON濃度的消耗均快于米氏凱倫藻單獨培養下的(見圖2)。這與吸收動力學擬合結果一致，即中肋骨條藻對各形態氮的最大吸收速率均大于(p<0.05，α=0.05)米氏凱倫藻的，同時也顯示中肋骨條藻對各形態氮吸收的最小濃度閾值和半飽和常數均低于(p<0.05，α=0.05)米氏凱倫藻的(見表4)。有研究表明中肋骨條藻對各種形態氮均有較好的吸收利用能力，包括硝氮、銨氨等無機態氮，尿素、丙氨酸等有機態氮，且在復合氮源條件下，中肋骨條藻的生長狀況比單一氮源時更好，適合在高氮環境下生長，近岸海域豐富的有機氮以及較高的氮濃度可能是其爆發性生長引發赤潮的重要原因[54-55]。也有其他研究表明中肋骨條藻對DON有很高的親和力而且能利用大部分的DON[56]。而米氏凱倫藻對有機氮的利用具有選擇性，研究發現米氏凱倫藻能以尿素作為唯一氮源生長，并且米氏凱倫藻對尿素的吸收利用能力要優于對NH4-N和NO3-N的吸收利用[57-58]。Li等利用15N示蹤技術進行的現場實驗表明甘氨酸能被米氏凱倫藻吸收利用，但米氏凱倫藻對甘氨酸的親和力要低于對尿素的親和力[59]。也有一些實驗室研究認為米氏凱倫藻不能利用游離氨基酸，如研究發現，米氏凱倫藻不能以甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、1，4-丁二胺鹽酸鹽這幾種有機氮源生長[60-61]，更有研究認為高濃度的氨基酸會抑制米氏凱倫藻的生長[57]。而且發現在低營養鹽條件下，甲藻生長得比中肋骨條藻好，而在營養鹽豐富的條件下，中肋骨條藻又會在競爭中處于優勢地位[62-64]。這與本研究中混合藻培養中肋骨條藻能競爭成為優勢種的結果一致。

表4 添加畜禽養殖源的不同組分溶解有機氮條件下米氏凱倫藻的氮吸收動力學參數

(紅色線是硝氮，黑色線是氨氮，藍色線是溶解有機氮，綠色線是顆粒氮。a、b、c是添加DON原水組分，d、e、f是添加DON親水組分，g、h、i是添加DON疏水組分，j、k、l是對照組。Red lines are NO3-N；Black lines are NH4-N；Blue lines are DON；Green lines are PN.a、b、c are add to Terrestrial aquaculture source；d、e、f are add to Hydrophilic components；g、h、i are add to Hydrophobic components；j、k、l are Control groups.)

本研究結果顯示中肋骨條藻和米氏凱倫藻對親水DON的吸收都大于對疏水DON的吸收，表現在米氏凱倫藻親水DON組、疏水DON組的DON濃度分別下降了27.19和21.08 μmol·L-1，中肋骨條藻親水DON組、疏水DON組的DON濃度分別下降了30.2和22.02 μmol·L-1，吸收動力學結果顯示(見表5)，米氏凱倫藻和中肋骨條藻對親水DON的吸收速率大于對疏水DON的吸收速率，對親水DON吸收的半飽和常數也低于疏水DON的。本研究無法避免培養體系中DIN的存在，但是不影響不同組分DON對浮游植物生長影響的認識，疏水組分較親水組分來說，利用率相對較低，但是疏水組分中的部分DON也可以促進浮游植物的生長。在自然系統中，疏水DON不能被浮游植物直接吸收快速利用，但可能在更長的時間尺度上對浮游植物的生長起作用，通過酶的降解，可保證DON在水生生態系統中的有效循環[64]。目前我國對DON的檢測并未列入常規檢測項目，對于DON中的重要組成部分的具有生物可利用性的尿素和氨基酸也未列入檢測項目。有必要將DON做監控，以提高赤潮預警預報的準確性，其次，從根源上減少陸源DON的輸入，從而減少赤潮的爆發。

表5 添加畜禽養殖源的不同組分溶解有機氮條件下中肋骨條藻的氮吸收動力學參數

2.3 亮氨酸氨肽酶(LAP)活性

雖然本實驗浮游植物表面會存有細菌，但是在一些實地研究中發現，浮游植物而非細菌對LAP活性的貢獻很大[65-66]。其中Stoecker D K等[67]研究了非無菌條件下幾種甲藻的亮氨酸氨肽酶活性，發現60%～99%的LAP活性(亮氨酸氨肽酶活性)存在于>5 μm的部分，表明LAP活性與甲藻有關，而不是與細菌有關。同時，Ou等[68]的研究也表明大約60%～70%的LAP活性與大于5 μm的浮游植物有關。因此本文認為培養體系中的亮氨酸氨肽酶主要是浮游植物產生的。

圖3為添加了陸源DON不同組分的各個培養體系中LAP酶活性實驗結果。在米氏凱倫藻培養體系中，不同實驗組的酶活性隨著時間先升高后降低，各實驗組的酶活性均在約第5天達到最大值，在培養實驗后期，由于體系內無機氮鹽的耗盡和米氏凱倫藻分泌的DON，酶活性在第15天開始升高，并且在18天左右達到最大值。在中肋骨條藻培養體系內，不同實驗組酶活性隨著時間先升高后降低，各實驗組的酶活性均在約第4天達到最大值。在雙藻混合培養體系內，不同實驗組的酶活性隨著時間先升高后降低，各實驗組的酶活性均在約第2天達到最大值。比較酶活性顯示，米氏凱倫藻組的酶活性大于(p<0.05，α=0.05)中肋骨條藻組見表6，說明米氏凱倫藻主要通過胞外酶來利用DON，其通過胞外酶降解DON的能力強于中肋骨條藻。但米氏凱倫藻生長速率低于中肋骨條藻，又說明在吸收DON或其降解產生的DON的能力上低于中肋骨條藻，這從其較低的吸收速率上可以看出。同樣，添加疏水性DON培養組的酶活性均大于(p<0.05，α=0.05)添加親水性DON組的見表6，說明浮游植物對疏水性DON的吸收利用需要通過胞外酶降解，而親水性DON則可以直接被吸收利用，這與親水性DON對浮游植物的促進作用大于疏水性DON的結果一致。此外，浮游植物在分泌胞外酶的過程中，也會消耗物質和能量，從而導致對生長供應的不足。而且，一旦浮游植物將酶釋放到水體中，失去細胞的保護，在物理、化學等作用下更容易失活[64]。

(紅色線是添加DON親水組分，黑色線是添加DON原水組分，藍色線添加DON疏水組分，綠色線是對照組。Red lines are add to Hydrophilic components; Black lines are add to Terrestrial aquaculture source; Blue lines are add to Hydrophobic components; Green lines are Control groups.)

表6 添加了畜禽養殖源不同組分條件下米氏凱倫藻和中肋骨條藻培養體系亮氨酸氨肽酶酶活性最大值

3 結論

本文采用一次性營養鹽加富培養實驗研究畜禽養殖源DON及其不同組分對中肋骨條藻和米氏凱倫藻生長的影響，主要結果如下：

(1)畜禽養殖源DON對中肋骨條藻生長的促進作用大于對米氏凱倫藻的，雙藻混合培養時，中肋骨條藻會競爭成為優勢種，體現在中肋骨條藻的最大生長速率、終止生物量和氮營養鹽吸收速率常數均大于米氏凱倫藻，同時半飽和常數和亮氨酸氨肽酶活性小于米氏凱倫藻。

(2)畜禽養殖源DON的親水組分比疏水組分更能促進浮游植物的生長，體現在中肋骨條藻和米氏凱倫藻親水DON組的終止生物量和最大生長速率、最大吸收速率大于疏水DON組的，同時疏水DON組的酶活性大于親水DON組的。