比利時杜鵑花RhDFR基因克隆及分析

蔣寶鑫，汪慶昊，楊國霞，賈永紅，謝曉鴻，吳月燕*

(1 浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江寧波 315100；2 浙江萬里學院 設計與建筑學院，浙江寧波 315100)

大多數杜鵑花(Rhododendron)屬于觀賞性花卉，具有重要的生態影響、觀賞和藥用價值，廣泛分布于亞洲、北美和西歐。杜鵑花是中國特有的觀賞性花卉品種之一，其花色艷麗，以滿足花卉市場的需要[1-3]，因此，培育不同花色的杜鵑花品種是目前研究的熱點。影響杜鵑花花色的主要是花青素和黃烷醇，花青素是花卉顏色的重要色素，決定了園藝植物的觀賞價值和經濟價值[4]。尤其是花青素成分(即矢車菊素、飛燕草素、錦葵素、天竺葵素、牡丹素和矮牽牛素等)的組成，它們的數量決定了花瓣從淺色到深色的花色變化[5]。因此，了解花青素合成途徑中相關基因的合成以及花青素合成途徑中關鍵基因對花卉品質的作用具有重要意義。

二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)作為花青素生物合成中的關鍵酶，在花青素合成過程中起著至關重要的作用[6]。該酶通過還原3種無色、相應的二氫黃酮醇(二氫山奈酚DHK、二氫槲皮素DHQ和二氫楊梅素DHM)催化黃烷-3，4-二醇(亮花青素)的產生，這也是黃酮醇合成反應的中間體[7]。DFR以NADPH為輔助因子，催化二氫黃酮醇還原成各自的亮花青素，這些是花青素和原花青素生物合成的常見前體。無色不穩定的亮花青素是合成花青素的直接前體，是花瓣和果實中主要的水溶性色素。它們也是兒茶素和原花青素的前體，參與植物抗病性，也影響植物產品的質量[8-10]。DFR存在底物特異性，這個特性通常決定植物積累的花青素類型[11]。DFR基因同源物已從許多植物物種中分離出來，二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)最早是從玉米(Zeamays)中分離鑒定[12]，中國水仙(Narcissustazettavar.chinensis)[13]、新疆雪蓮(SaussureainvolucrataKar.et Kir.)[14]和黃芩(Scutellariabaicalensis)[15]等多種植物中已分離克隆出DFR基因。鄭好等[6]發現在芥藍(Chinese Kale)不同發育時期和不同器官中其BoaDFR表達水平存在顯著差異。武博等[16]分析發現毛白楊(Populustomentosa)二氫黃酮醇-4-還原酶基因PtDFR蛋白具有2個保守結構域[NADP(H)結合位點和底物特異性結合位點]。研究表明DFR基因作為花青素合成的關鍵酶基因，對植物的著色有著關鍵的作用。對矮牽牛(Petuniahybrida)介導舞春花(Calibrachoahybrids)CaDFR基因進行過表達，觀察到轉基因矮牽牛的花蕾和花色與對照組相比發生變化[17]。從紫萼(Hostaventricosa)克隆的HvDFR基因轉入煙草中增加了煙草花青素的積累[18]。研究說明，DFR的表達情況對植物花色有重要影響。王云生等[19]在茶樹(Camelliasinensis)中利用原核表達純化出目的蛋白，利用HPLC-MS方法對重組蛋白進行了體外酶活檢測，目的蛋白具有DFR酶活性。因此，研究DFR底物特異性機理對花色改良和育種具有重要意義。

本試驗采用RT-PCR和RACE技術從比利時杜鵑花中克隆獲得DFR基因，通過生物信息學分析對比利時杜鵑花RhDFR蛋白結構進行分析；利用植物酶聯免疫試劑盒(ELISA)對紅色和白色比利時杜鵑花不同發育時期DFR活性進行測定；利用qRT-PCR技術分析RhDFR基因在紅色和白色比利時杜鵑花不同器官和不同發育時期花瓣的表達情況，為RhDFR基因的表達和功能研究奠定了基礎；通過構建原核表達載體pET-28a-RhDFR轉化大腸桿菌(BL21)進行原核誘導表達。本試驗為從分子角度分析杜鵑花花色差異變化提供了思路，也為其他觀賞性物種花色改良及更深入探討杜鵑花花青素合成途徑供了科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料于2022年7月在中國寧波北侖柴橋萬景杜鵑良種園(E121°27′40″～122°10′22″，N29°41′44″～29°58′48″)中采集。選擇生長良好的紅色和白色比利時杜鵑花為實驗材料。比利時杜鵑花花朵發育4個時期(花苞期、初開期、盛開期和衰敗期)及不同器官(分為雌蕊、瓣化雄蕊、花瓣和葉片)如圖1所示。采后立即置于液氮中，然后放入-80 ℃超低溫冰箱內儲存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成用液氮研磨紅色比利時杜鵑花樣品，使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取花瓣總RNA。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和SpectraMax 190全波長酶標儀(北京龍躍生物科技發展有限公司)測定總RNA的質量和濃度。按照NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)反轉錄試劑盒(上海近岸科技有限公司)說明書逆轉錄合成cDNA。使用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit RACE試劑盒(寶日醫生物技術有限公司)說明書逆轉錄合成3′/5′cDNA[20-21]。

1.2.2RhDFR基因全長克隆及生物信息學分析從NCBI數據庫中下載其他植物DFR基因序列。使用Primer 6.0軟件進行簡并引物DFR-R1和DFR-F1設計(表1)。以紅色比利時花苞時期杜鵑花cDNA為模板，按照2×FastPfuMasterMix酶(上海近岸科技有限公司)說明書進行PCR擴增。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收與目的片段大小相同的PCR產物，將PCR擴增回收產物與pEASY?-BluntCloningKit(北京全式金生物技術股份有限公司)載體連接并轉化到大腸桿菌DH5α菌株中。將感受態細胞均勻涂布于具有卡那霉素(100 mg·mL-1)抗性的LB固體培養基上，將平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中。挑選過夜培養平板的單一菌落，利用M13F和M13R通用引物進行菌液PCR，篩選陽性克隆菌，進行測序(北京擎科生物科技有限公司)。使用Primer 6.0軟件進行RACEDFR-5′和DFR-3′的引物設計(表1)，后續實驗過程與保守區域克隆相同，從而獲得DFR-5′和DFR-3′基因的核苷酸序列。使用DNAMAN 8軟件進行序列拼接，根據拼接結果使用Primer 6.0軟件設計全長引物DFR-R2和DFR-F2(表1)，后續實驗過程與保守區域克隆相同，從而獲得DFR基因全部核苷酸序列。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

使用DNAMAN 8.0軟件進行同源蛋白質多序列比對；下載其他植物的二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)序列[Gen Bank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]，利用MEGA 6.0 軟件構建系統進化樹分析；采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)和Protscale(http://web.expasy.org/protscale)網站對RhDFR蛋白結構、分子構成、等電點、糖基化位點、磷酸化位點和親疏水性進行分析；采用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和Swiss Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)網站對RhDFR蛋白質二級結構和三級結構預測；采用CDD網站對RhDFR蛋白功能結構域分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)；采用NetPhos 網站對RhDFR蛋白磷酸化位點分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。

1.2.3 RhDFR活性測定利用植物酶聯免疫試劑盒(ELISA)對紅色和白色比利時不同發育時期RhDFR活性進行測定。根據對應的ELISA試劑盒說明書對紅色和白色比利時杜鵑花不同時期花瓣樣品進行粗酶液提取。使用液氮對樣品進行研磨，分別稱取0.1～0.2 g研磨后的樣品，加入1 mL PBS(pH 7.4)緩沖液，4 ℃、8 000 r/min離心30 min，取上清液通過0.45 μm微孔過濾器過濾，4 ℃保存。根據對應酶的植物酶聯免疫試劑盒說明書進行RhDFR活性測定。

1.2.4 比利時杜鵑RhDFR基因表達量分析實驗所用qRT-PCR的引物序列為全長引物DFR-R3和DFR-F3(表1)。使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取實驗材料總RNA，按照NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)反轉錄試劑盒合成熒光cDNA。按照NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus(上海近岸科技有限公司)試劑盒進行qRT-PCR分析。反應體系包括35 μL的2×No-voStart?SYBR qPCR SuperMix Plus，正、反向引物各1.4 μL，1.4 μL 熒光cDNA，30.8 μL ddH2O，總體積70 μL。反應程序為預變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s；60 ℃ 1 min；30個循環。采用2-ΔΔCT[22]法計算基因相對表達量。實驗所用Actin-R和Actin-F作為內參基因[23]。每種樣品都設3次重復。

1.2.5RhDFR基因的原核表達使用Primer 6.0軟件設計帶有酶切位點的上下游引物DFR-F4和DFR-R4(下劃線20 bp為載體序列)(表1)。以比利時杜鵑花花瓣cDNA為模版，利用2×EasyTaq?PCR Super Mix酶進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增回收產物與目的片段大小相同。用EcoRI-HF酶(紐英倫生物技術有限公司)將pET-28a質粒(武漢淼靈生物科技有限公司)進行單酶切，酶切產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切產物進行割膠回收純化，使用NovoRec?plus One step PCR Cloning Kit(上海近岸科技有限公司)連接酶試劑盒說明書將純化產物按載體片段和插入片段摩爾比1∶2連接后。再將連接后pET-28a-RhDFR載體輕輕混勻加入大腸桿菌DH5α感受態細胞中。將一定量的菌體均勻涂布在含Kan的抗生素平板上，37 ℃倒置過夜培養。挑取重組的單一菌落進行菌液PCR鑒定，將質粒送樣測序。

1.2.6 RhDFR重組蛋白制備與純化將重組質粒pET-28a-RhDFR和空載質粒pET-28a加入大腸桿菌BL21感受態細胞中輕輕混勻。將轉化后的感受態細胞加到含Kan抗性的固體培養基，37 ℃倒置過夜培養。挑取重組的單一菌落進行菌液PCR鑒定。將重組質粒pET-28a-RhDFR和空載質粒pET-28a陽性菌落預培養于10 mL含有Kan抗性的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min過夜。當菌液吸光度(A600 nm)達到0.5～0.8時，加入0.8 mmol/L IPTG溶液，在37 ℃條件下誘導重組蛋白4 h[24]。誘導結束后4 ℃、8 000 r/min離心10 min收菌，用2 mL 0.1%磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮沉淀，對沉淀進行超聲處理，4 ℃、13 000 r/min離心10 min后吸取上清液，用2 mL 0.1%磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮沉淀。分別收集上清和沉淀，然后取20 μL蛋白樣品加入20 μL DTT混勻，100 ℃水浴加熱5～10 min，冷卻至室溫使蛋白變性，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10% SDS-PAGE)驗證重組蛋白可溶性。使用His60鎳超流樹脂和重力柱對可溶性重組蛋白進行純化，收集洗脫液，將洗脫液中的蛋白進行10% SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2 結果與分析

2.1 RhDFR基因的克隆

以紅色比利時杜鵑花cDNA為模板，利用簡并引物進行PCR擴增獲得542 bp保守區序列(圖2，A)；基于保守區序列的RACE擴增，分別獲得808 bp的3′序列(圖2，B)和817 bp的5′序列(圖2，C)。利用DNAMAN軟件將保守、5′和3′區序列進行比對拼接，得到RhDFR基因全長為1 253 bp，其中包含1 035 bp的完整ORF序列(圖2，D)，編碼344個氨基酸。

M.DL2000；A.保守區；B.5′-RACE；C.3′-RACE；D.ORF圖2 比利時杜鵑花DFR基因 PCR 擴增M.DL2000;A.Conserved zone;B.5′-RACE;C.3′-RACE;D.ORFFig.2 PCR amplification of DFR gene in Rhododendron hybridum Hort.

2.2 RhDFR基因生物信息學分析

通過ProtParam和Protscale網站預測RhDFR蛋白理化性質及親疏水性。其分子式為C1730H2682N442O512S16，相對分子質量為38 377.94 Da，理論等電點為5.47，總的負電荷殘基(Asp+Glu)為45，總的正電荷殘基本(Arg+Lys)為36，不穩定指數(Ⅱ)為31.81，親水性平均值為-0、186，脂肪系數為82.18。結果表明，RhDFR蛋白為酸性、帶負電荷穩定的親水性蛋白。

通過CDD網站對RhDFR蛋白功能結構域進行分析。結果表明，比利時杜鵑花RhDFR蛋白具有一個NADPH結合結構域和一個底物特異性結合結構域。

如圖3所示，采用NetPhos網站對RhDFR蛋白磷酸化位點進行分析。結果表明，RhDFR蛋白存在25個磷酸化位點，其中絲氨酸16個，蘇氨酸12個，酪氨酸6個。

圖3 RhDFR蛋白磷酸化位點分析Fig.3 Analysis of RhDFR protein phosphorylation sites

如圖4所示，采用Protscale對RhDFR蛋白疏水性進行分析。RhDFR蛋白質存在明顯的疏水區和親水區，其中第194位最高為3.056；第97和98位最低為-2.333。結果表明，RhDFR蛋白質為親水性蛋白質。

圖4 RhDFR蛋白質疏水性/親水性預測Fig.4 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of RhDFR

如圖5所示，利用SOPMA對RhDFR基因編碼的蛋白質進行二級結構預測。結果表明，有132個氨基酸參與形成α螺旋，有44個氨基酸參與形成延伸鏈，有20個氨基酸參與形成β-轉角和有144個氨基酸參與形成無規則卷曲，分別占38.37%、13.95%、5.81%和41.86%。RhDFR蛋白主要由無規則卷曲和α-螺旋結構組成。

圖5 RhDFR蛋白二級結構預測Fig.5 Predicted secondary structure of RhDFR protein

如圖6所示，采用Swiss Model網站對RhDFR蛋白質三級結構預測。結果表明，RhDFR蛋白質三級結構與二級結構預測結果一致，含有無規則卷曲、α-螺旋、β-轉角和延伸鏈結構。

圖6 RhDFR蛋白三級結構預測Fig.6 Predicted tertiary structure of RhDFR protein

如圖7所示，利用DNAMAN 8.0軟件進行蛋白質多序列比對，RhDFR基因編碼的氨基酸與鳳仙花(Impatiensglandulifera)、獼猴桃(Actinidiachinensis)、矢車菊(Centaureacyanus)、仙客來(Cyclamengraecum)、斑點矢車菊(Centaureamaculosa)、向日葵(Helianthusannuus)、雪蓮(Saussureainvolucrata)、越橘(Vacciniumcorymbosum)和紫錐果菊(Echinaceapurpurea)中的DFR蛋白相似性分別為78.53%、88.41%、76.52%、81.40%、77.23%、74.86%、76.52%、92.75%和71.79%。結果表明，RhDFR蛋白含有與一個NADPH結合的保守基序和一個特異結合區，因此初步推測RhDFR蛋白為DFR蛋白的編碼序列。

圖7 RhDFR與不同物種DFR蛋白的氨基酸序列比對Fig.7 Amino acid sequence comparison of RhDFR with DFR proteins of different species

如圖8所示，利用MEGA 6.0 軟件構建系統進化樹分析，從NCBI中下載其他物種的目的蛋白序列。比利時杜鵑花RhDFR蛋白與越橘DFR(Vacciniumcorymbosum，AHK23093.1)親緣關系最近。

圖8 RhDFR與其他植物DFR蛋白的系統進化樹分析Fig.8 Phylogenetic tree analysis of RhDFR and other plant DFR proteins

2.3 比利時杜鵑花瓣不同發育時期DFR活性的變化

如圖9所示，在紅色與白色比利時杜鵑花不同發育時期DFR活性呈先上升后下降的趨勢，紅色比利時杜鵑花在初開期DFR活性最高，而白色比利時杜鵑花在盛開期DFR活性最高。在紅色和白色比利時杜鵑花不同發育時期，白色比利時杜鵑花在盛開期和衰亡期的DFR活性高于相應紅色比利時杜鵑花，其活性分別約為紅色比利時杜鵑花的1.31和1.26倍。而紅色比利時杜鵑花在花苞期和初開期DFR活性高于白色比利時杜鵑花，其DFR的活性分別約為白色比利時杜鵑花的1.33和1.23倍。

不同小寫字母表示不同花期在0.05水平差異顯著性，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著性，圖11同圖9 比利時杜鵑花不同發育時期RhDFR活性Different normal letters indicate significant differences at 0.05 level,and different capital letters indicate that they differ significantly at 0.01 level,the same as Fig.11Fig.9 RhDFR activity at different development stages in R. hybridum Hort.

2.4 比利時杜鵑花不同器官及花瓣不同發育時期DFR基因的空間表達特性

2.4.1 比利時杜鵑花不同組織RhDFR基因表達量如圖10所示，利用qRT-PCR技術在紅色和白色比利時杜鵑花葉子、花瓣、雄蕊和雌蕊中分析了RhDFR基因表達水平。結果表明，在比利時杜鵑花不同器官中，RhDFR表達量存在明顯差異。紅色和白色比利時杜鵑花RhDFR表達量均在花瓣中最高，顯著高于其他器官，其次是葉子，最低的是雄蕊。紅色比利時杜鵑花不同組織的RhDFR基因表達量高于白色比利時杜鵑花，其中紅色比利時杜鵑花葉子、雄蕊、雌蕊和花瓣DFR基因表達量分別約為白色比利時杜鵑花的1.56、1.27、1.10和1.40倍。

不同小寫字母表示不同組織間在0.05水平差異顯著性，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著性圖10 比利時杜鵑花RhDFR在不同器官中的表達Different normal letters indicate significant differences at 0.05 level,and different capital letters indicate that they differ significantly at 0.01 levelFig.10 Expression of RhDFR in R. hybridum Hort.in different organs

2.4.2 比利時杜鵑花花瓣不同發育時期RhDFR基因表達量從圖11可知，在杜鵑花4個階段的生長過程中，紅色和白色比利時杜鵑花花瓣中RhDFR的表達量均呈現先上升后下降的趨勢，紅色比利時杜鵑花在初開期表達量最大，而白色比利時杜鵑花在盛開期表達量最大。紅色比利時杜鵑花中RhDFR的基因表達量均高于同期白色比利時杜鵑花RhDFR基因表達量。其中，紅色比利時杜鵑花在花苞期、初開期、盛開期和衰亡期的花瓣RhDFR基因表達量約為白色比利時杜鵑花的1.58、5.65、1.43和1.79倍。

圖11 比利時杜鵑花RhDFR在不同發育時期的表達Fig.11 Expression of RhDFR in R. hybridum Hort.petals at different periods

2.5 RhDFR蛋白制備和純化

如圖12所示，將測序正確的重組質粒pET-28-RhDFR和空載質粒pET-28轉入大腸桿菌(BL21)中，以空載質粒pET-28轉入大腸桿菌作為蛋白陰性對照。用10% SDS-PAGE凝膠電泳分析，可溶性重組蛋白大小約為38 kD，與預期大小相近。結果說明RhDFR蛋白在大腸桿菌中成功表達。

M.蛋白標準；1.誘導前對照菌；2.誘導表達菌體；3和4為未加IPTG誘導劑對照菌的沉淀和上清液；5和6為加入IPTG誘導劑表達菌體的沉淀和上清液圖12 重組RhDFR蛋白的10% SDS-PAGE分析M.Protein standard;1.Control bacteria before induction;2.Induced expression organisms;3 and 4 are precipitates and supernatants of control bacteria without IPTG inducer;5 and 6 are precipitates and supernatants of expression organisms with IPTG inducer addedFig.12 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhDFR protein

如圖13所示，使用His60鎳超流樹脂和重力柱對加入IPTG誘導劑的上清液中pET-28-RhDFR重組質粒進行蛋白純化。用10% SDS-PAGE凝膠電泳分析，純化后的RhDFR蛋白大小約為38 kD，與理論值相近。

M.蛋白標準；1為純化后的重組質粒pET-28-RhDFR圖13 重組RhDFR蛋白純化后的10% SDS-PAGE分析M.Protein standard;1 The purified recombinant plasmid pET-28-RhDFRFig.13 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhDFR protein after purification

3 討 論

二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)基因在植物中表現出很強的序列保守性。通過生物信息學分析中，在比利時杜鵑花花青素生物合成中，RhDFR含有一個NADPH結合的保守基序和一個特異結合區，與玫瑰(Rosarugosa)RrDFR1[25]、矮牽牛(Petuniahybrida)PhDFR[25]、滇牡丹(Paeoniadelavayi)PdDFR[26]、羽衣甘藍(Ornamental Kale)BoDFR[27]、滇牡丹DFR[28]和紅花CtDFR1(CarthamustinctoriusL.)[29]蛋白結合位點相同。RhDFR基因序列所編碼的氨基酸序列與其他物種DFR編碼的氨基酸序列具有較高的相似性，具有相應的保守區域、活性位點和結合位點等，因此推測他們編碼相同的蛋白。系統進化樹分析表明，RhDFR蛋白與越橘DFR蛋白親緣關系最近。本研究通過RT-PCR技術和RACE技術從比利時杜鵑花中克隆RhDFR的基因序列，RhDFR全長1 253 bp，ORF長度為1 035 bp，編碼344個氨基酸；RhDFR蛋白為酸性、帶負電荷穩定的親水性蛋白。

潘怡辰[30]研究表明黑粒小麥(Black-greined what)在灌漿期DFR活性呈先上升后下降的趨勢。本實驗研究結果與之相同，在紅色和白色比利時杜鵑花不同發育時期DFR活性都呈先上升后下降的趨勢，紅色比利時杜鵑花在初開期DFR活性最高，而白色比利時杜鵑花在盛開期DFR活性最高，研究表明紅色和白色比利時杜鵑花具有RhDFR活性。在國內外研究中未發現其他觀賞性植物DFR活性的檢測。利用qRT-PCR技術對紅色和白色比利時杜鵑花不同器官及花瓣不同發育時期RhDFR基因的表達差異進行分析，從不同器官中的基因表達量來看，RhDFR基因在花瓣中的表達水平最高，其中紅色比利時杜鵑花不同組織的RhDFR基因表達量高于白色比利時杜鵑花。這與葡萄風信子(Muscariarmeniacum)MaDFR[7]、黃芩SbDFR[15]基因的表達量趨勢一致，在花瓣中DFR基因的表達水平最高。在紅色和白色比利時杜鵑花花瓣發育的不同階段，RhDFR在紅花發育到初開期時表達水平最高，白花則在盛開期的表達水平最高。嚴朋飛等[31]發現威氏綠絨蒿(Meconopsiswilsonii)在開花過程中MwDFR基因表達量也呈先上升再下降的趨勢；齊宇[32]報道玫瑰DFR基因表達量也呈先上升再下降的趨勢，并在初開期達到峰值，均與RhDFR表達結果相同。結果證明，在紅色和白色比利時杜鵑花不同發育時期DFR活性和基因表達量都呈正相關。紅色和白色比利時杜鵑花DFR活性及基因表達量分別在初開期和盛開期最高。

本實驗在成功克隆獲得比利時杜鵑花RhDFR基因的基礎上構建pET-28-RhDFR重組表達載體，并對其進行了誘導表達。研究顯示，與潘麗晶等[33]石斛蘭(Dendrobium)DenDFR基因的原核表達驗證結果相符。在原核表達體系中，二氫黃酮醇 4-還原酶(DFR)融合蛋白在上清液中表達[34]，這與本實驗結果相符。本研究中在37 ℃誘導4 h條件下pET-28-RhDFR目的蛋白以可溶性形式存在[34-35]。本試驗使用His60鎳超流樹脂和重力柱對pET-28-RhDFR重組質粒進行蛋白純化，純化后的RhDFR蛋白大小約為38 kD，與理論值相近。

本研究以紅色和白色比利時杜鵑花的不同器官和不同發育時期花瓣為實驗材料，克隆得到RhDFR基因，并對RhDFR基因進行生物信息學分析，也對比利時杜鵑花不同發育階段RhDFR活性檢測；還通過qRT-PCR分析RhDFR基因在比利時杜鵑花不同發育階段和雌蕊、雄蕊、花瓣和葉片中的表達量；同時成功制備pET-28-RhDFR重組蛋白。比利時杜鵑花RhDFR基因克隆及表達研究尚未見報道，本研究首次克隆得到的比利時杜鵑花二氫黃酮醇4-還原酶(RhDFR)基因，并對該基因表達量和蛋白進行相關驗證。上述研究表明，杜鵑花中RhDFR活性的功能多樣化，DFR基因與比利時杜鵑花花瓣的顏色有關。本研究結果對深入探討杜鵑花花色調控分子機制有著重要意義，也為進一步研究RhDFR基因功能奠定了基礎。