NaCl脅迫下寧夏枸杞光合作用相關基因差異表達分析

胡進紅，宋 繁，梁旺利，于雯靜，王玲霞，梁文裕

(寧夏大學 生命科學學院,銀川 750021)

土壤鹽堿化是全球生態環境和農業生產面臨的日益嚴峻的挑戰。鹽脅迫是植物面臨的主要非生物脅迫之一，會導致植物遭受離子毒害、滲透脅迫和氧化損傷[1]，對植物形態、細胞內穩態、代謝、酶活性以及離子運輸、吸收和分配等產生不利影響，可降低植物生物量、葉肉導度、氣體交換、蒸騰速率和光合能力[2-3]。而且鹽脅迫下的Na+在葉綠體中快速、過度積累會導致葉綠體結構發生變化，影響光系統Ⅱ功能和電子通量密度[4]。因此，鹽脅迫對植物光合機構和光合作用具有明顯的影響。

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科枸杞屬的多年生落葉灌木，其果實枸杞子是著名藥材，根、莖、葉和籽也都具有豐富的藥用價值和營養保健價值[5]。此外，寧夏枸杞具有耐鹽堿和繁殖能力強等優良特性[6]，也是鹽堿地改良和園林綠化的優選藥用植物。雖然目前鹽脅迫對寧夏枸杞的光合生理的影響有了初步的認識，如枸杞葉肉細胞形狀改變，葉綠體結構變形，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔限制值和氣孔導度隨NaHCO3脅迫濃度的升高而下降，但細胞間隙CO2濃度升高，水分利用率呈先升后降的趨勢[7]。由于鹽脅迫下植物光合作用相關基因的差異表達對光合速率和光合活性具有重要的調控作用[8]，而寧夏枸杞在鹽脅迫條件下光合機構及光合作用相關基因如何響應鹽脅迫的機制并不明確。因此，本研究采用高通量測序技術及生物信息學方法對寧夏枸杞響應NaCl脅迫的光合作用相關差異表達基因進行篩選，采用 qRT-PCR 進一步分析重要基因差異表達規律，并對光合代謝相關生理指標進行檢測，進而解析NaCl脅迫條件下寧夏枸杞光合相關基因差異表達規律，為深入認識寧夏枸杞耐鹽堿的光合分子機理奠定基礎，也為寧夏枸杞的開發利用和耐鹽品種的培育提供理論和試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

寧夏枸杞品種‘寧杞1號’由寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所惠贈。寧夏枸杞幼苗基質培養1個月后進行Hoagland營養液水培(溫度25±2 ℃、濕度42%、光周期16 h/8 h、光照強度60 μmol·m-2·s-1)，培養至8～12葉期時，將長勢一致、健康的幼苗在添加NaCl的Hoagland溶液中進行NaCl脅迫處理。試驗共設置0 (對照組A)、100 (處理組B)、200 (處理組C)和300 (處理組D)mmol/L NaCl等4個處理。NaCl處理后第7天采集葉片樣品(圖1)，每個處理分別隨機剪取葉肉組織3 g混勻，液氮處理后，置于-80 ℃冰箱中備用。各處理設置3次生物學重復。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA測序文庫構建不同濃度NaCl脅迫處理的寧夏枸杞葉片總RNA利用(Tiangen)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進行提取。樣品總RNA質量檢測合格后構建cDNA測序文庫。使用 Qubit2.0初步定量測序文庫，稀釋至1 ng/μL的文庫插入片段采用安捷倫2100進行檢測。使用定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)方法準確定量插入片段符合預期文庫的有效濃度(文庫有效濃度>2 nmol/L)，以確保其質量達到送樣要求。

1.2.2 Illumina HiSeq 測序、質控及從頭組裝通過高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對已構建好的文庫進行測序獲得原始數據 (raw reads)，將原始數據中帶接頭(adapter)的讀段(reads)、無法確定堿基信息比例大于10%的讀段和低質量讀段進行過濾處理，獲得干凈讀段(clean reads)。利用Trinity軟件對干凈讀段(clean reads)進行從頭組裝獲得后續分析的參考序列。

A.0 mmol/L NaCl;B.100 mmol/L NaCl;C.200 mmol/L NaCl;D.300 mmol/L NaCl;下同圖1 不同濃度NaCl處理7 d后的寧夏枸杞幼苗A.0 mmol/L NaCl;B.100 mmol/L NaCl;C.200 mmol/L NaCl;D.300 mmol/L NaCl;The same as belowFig.1 The L. barbarum seedlings stressed under different concentrations of NaCl for 7 days

1.2.3 差異基因功能注釋及差異基因篩選將獲得的轉錄組序列在Nr、Pfam、Swiss-prot、KEGG、GO數據庫進行blastx比對獲得基因功能注釋。采用DESeq2進行基因的差異表達分析，以P<0.05且[|log2(FoldChange)|>1]為標準篩選與光合作用相關代謝的差異表達基因。

1.2.4 光合作用相關基因的qRT-PCR分析選擇與光合作用相關的部分重要差異表達基因進行qRT-PCR驗證。qRT-PCR定量實驗使用(Vazyme)諾唯贊生物科技有限公司(中國，南京)試劑盒完成。根據轉錄組測序結果中的轉錄本序列，用Premier 5.0設計目的基因擴增引物(表1)，Actin為內參基因，用Roche LightCycler480型定量PCR儀進行反應。PCR擴增條件為95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，1 min；共41個循環。每個反應3次重復，采用2-ΔΔCt法[9]對表達量進行分析。

表1 基因功能注釋及引物序列Table 1 Gene function annotation and primer sequences

1.2.5 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片光合色素含量測定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量參照丙酮比色法測定[10]。稱取0.2 g葉片，加適量碳酸鈣、二氧化硅和3 mL 80%丙酮研磨至勻漿后，加10 mL 80%丙酮避光提取5 min后，將提取液倒入離心管中4 000 g離心10 min，將上清移至棕色容量瓶中并定容至25 mL。利用紫外分光光度計(TU-1810,PERSEE,China)在波長663、646和470 nm下測定吸光度并按樣品鮮重質量計算鹽脅迫下寧夏枸杞葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

1.2.6 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的測定使用德國GFS-3000便攜式光合儀測定寧夏枸杞葉片的凈光合速率。測定時設置氣體流速500 μmol·s-1，氣體混勻器的風扇速度為7，葉室溫度為29 ℃，相對濕度為60%，利用外置光源將PAR設定為1 800 μmol·m-2·s-1，各處理組選取長勢一致的獨立植株的中部葉片進行活體測定。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性采用蘇州夢犀生物醫藥科技有限公司試劑盒進行測定，按樣品蛋白濃度計算其活性。

1.3 數據處理

所有試驗均進行3次生物學重復。所得實驗數據用SPSS Statistics 26.0、Origin和Excel進行方差分析、檢驗結果的差異顯著性分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量評估

樣本測序數據中，每個樣本的錯誤率 ≤ 0.03%，測序堿基質量值大于20的堿基占總體堿基的百分比在97.28%以上、大于30的堿基在91.79%以上。GC含量占總堿基的44%左右，測序數據具有較高的準確性。對4個不同鹽脅迫處理的寧夏枸杞樣本進行相關性檢測，樣本間的相關系數均大于0.771(圖2)，表明測序數據可靠、樣本間重復性良好且變異不大。

圖2 樣本間皮爾遜相關系數Fig.2 Pearson correlation between samples

2.2 NaCl脅迫下寧夏枸杞光合作用相關基因的差異表達

對NaCl脅迫下寧夏枸杞所有差異表達基因進行KEGG pathway顯著性富集分析，篩選富集到與光合作用相關的代謝途徑的64個差異表達基因(P<0.05)(表2)，主要分布在卟啉和葉綠素代謝、類胡蘿卜素生物合成、光反應和卡爾文循環代謝通路。

表2 NaCl脅迫下寧夏枸杞參與光合作用的差異表達基因Table 2 Differentially expressed genes involved in photosynthesis of L. barbarum under NaCl stress

其中，以0 mmol/L NaCl處理組(A)為對照，100 mmol/L NaCl處理組(B)寧夏枸杞光合作用相關的差異表達基因共有14個，上調差異表達基因為8個，下調差異表達基因有6個；200 mmol/L NaCl處理組(C)寧夏枸杞光合作用相關的差異表達基因共有26個，上調差異表達基因有7個，下調差異表達基因19個；300 mmol/L NaCl處理組(D)寧夏枸杞光合作用相關的差異表達基因共有55個，上調差異表達基因有5個，下調差異表達基因共有50個(圖3)?？梢?，與光合作用相關的差異表達基因數目隨著NaCl脅迫程度的增加而增加，且下調基因數遠多于上調基因。

圖3 NaCl 脅迫下寧夏枸杞光合作用相關差異表達基因韋恩圖Fig.3 Venn diagram of photosynthesis-related differential genes in L. barbarum under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫下寧夏枸杞光合作用相關基因差異表達驗證分析

隨機挑選NaCl脅迫下寧夏枸杞的3個光合作用相關差異表達基因ATPε、CLH2、Lhcb3進行qRT-PCR分析。結果(圖4)表明，隨著NaCl脅迫程度的加深，ATP合酶ε亞基基因(ATPε)表達量呈顯著下降的趨勢(P<0.05)，但100、200和300 mmol/L NaCl處理組之間無顯著差異；葉綠素酶2基因(CLH2)表達量隨著NaCl脅迫程度的加深呈顯著下降的趨勢，并且各處理組間均差異顯著(P<0.05)；捕光色素復合體Ⅱ葉綠素a/b結合蛋白3基因(Lhcb3)在NaCl脅迫條件下總體呈顯著下降趨勢，并且各處理組間也均差異顯著(P<0.05)?？梢?，qRT-PCR結果與RNA-seq測序結果基本一致。

不同小寫字母表示處理組之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)；下同圖4 不同NaCl脅迫下寧夏枸杞光合相關基因的qRT-PCR分析Different normal letters indicate that there are significant differences between treatment at 0.05 level (P<0.05);The same as belowFig.4 Analysis of qRT-PCR data of photosynthesis-related genes in leaves of L. barbarum under NaCl stress

續表2 Continued Table 2

2.4 NaCl脅迫下寧夏枸杞光合色素含量的變化

圖5顯示，寧夏枸杞葉片葉綠素a含量隨NaCl脅迫程度的增加呈顯著降低的趨勢，而100、200、300 mmol/L NaCl處理間無顯著差異，它們均顯著低于對照；葉綠素b含量也隨NaCl脅迫程度增加呈逐漸降低的趨勢，且200和300 mmol/L NaCl處理與對照差異顯著，但在100、200、300 mmol/L NaCl處理間無顯著差異；類胡蘿卜素含量隨NaCl脅迫程度的增加無顯著變化。

圖5 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片光合色素含量變化Fig.5 Changes of photosynthetic pigment contents in leaves of L. barbarum under NaCl stress

2.5 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的變化

寧夏枸杞葉片的凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性均隨著NaCl脅迫程度的加深呈現逐漸顯著下降的趨勢(P<0.05)，各NaCl脅迫處理均顯著低于對照，200 和300 mmol/L NaCl處理又均低于100 mmol/L NaCl處理，而200 和300 mmol/L NaCl處理相比均無顯著差異(圖6)。

圖6 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性變化Fig.6 Changes of net photosynthetic rate and Rubisco activities in leaves of L. barbarum under NaCl stress

3 討 論

3.1 NaCl脅迫對寧夏枸杞光合色素相關基因差異表達的影響

植物對外界環境變化響應的重要途徑之一是調控葉綠素總含量及類胡蘿卜素含量變化[11]。葉綠素代謝是一個動態平衡的過程，鹽脅迫會打破這種平衡，使植物細胞色素代謝紊亂，從而直接降低了植物的光合能力[12]。本研究發現，隨著NaCl脅迫程度的增加寧夏枸杞葉片的葉綠素含量顯著下降，說明高濃度NaCl顯著影響了葉綠素的合成或分解。PAO、MCS和CLHs是葉綠素降解途徑的關鍵酶，POR、CAO等是葉綠素合成途徑的關鍵酶[13]。NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片PAO和MCS基因上調表達，而CLH2、CAO、POR基因下調表達，表明NaCl脅迫促進了寧夏枸杞葉綠素降解而抑制了葉綠素合成，進而導致葉綠素含量下降。因此，NaCl脅迫可導致寧夏枸杞通過誘導葉綠素合成相關基因下調表達和降解相關基因上調表達，進而調控葉綠素含量下降。

類胡蘿卜素具有捕獲光能、傳遞電子、防御光破壞、清除活性氧等作用[14]。番茄紅素ε-環化酶(LCYE)將ε環連接到番茄紅素上生成δ-胡蘿卜素，隨后在番茄紅素β-環化酶(CYCB)的催化下將β環連接到δ-胡蘿卜素的末端生成α-胡蘿卜素；CYCB在番茄紅素的2個末端各增加一個β環來催化產生β-胡蘿卜素[15]。α-胡蘿卜素在ε-胡蘿卜素羥化酶(CYP97C)和β-胡蘿卜素羥化酶(BCH3)的共同作用下最終生成葉黃素[16]。在煙草中過表達番茄紅素環化酶基因Ntb-LCY1不僅增加了β-胡蘿卜素、葉黃素等類胡蘿卜素的含量，同時也提高了清除活性氧的能力，從而提高煙草耐鹽和抗旱能力[17]。本研究發現寧夏枸杞葉片CYCB和BCH3基因在NaCl脅迫下上調表達，LCYE基因在高濃度NaCl脅迫下下調表達，而在低NaCl濃度下表達沒有顯著差異，而且類胡蘿卜素含量沒有隨著NaCl脅迫程度的增加發生顯著變化，表明寧夏枸杞在NaCl脅迫下可通過誘導CYCB、BCH3和LCYE基因差異表達進而調控類胡蘿卜素含量保持穩定，從而參與調控光合活性或維持ROS代謝平衡。

3.2 NaCl脅迫對寧夏枸杞光反應相關基因差異表達的影響

光合電子傳遞發生在葉綠體類囊體膜上，由捕光色素復合體(LHC)捕獲和傳遞光子，在放氧蛋白復合體的作用下將水分子氧化放氧。同時，Lhcb3、Lhcb4和Lhcb6在維持光系統的結構穩定和功能上也起重要作用[18]。有研究表明寧夏枸杞在300 mmol/L NaCl脅迫下葉綠體內類囊體膜發生解體，基粒片層數目減少或膨脹，排列疏松，同時雙層膜受到破壞，出現大的空泡現象[19]。本研究發現，寧夏枸杞葉片光反應中的捕光色素復合體LHC相關基因Lhca2、Lhca5、Lhcb1、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6在高濃度NaCl脅迫下均下調表達，而在低濃度NaCl脅迫下表達無顯著差異，表明低濃度NaCl脅迫下雖然寧夏枸杞凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性有下降現象，但其葉綠體結構完整[19]，且LHC相關基因正常表達，可維持正常的光合作用和生理代謝，但高濃度NaCl脅迫導致寧夏枸杞葉綠體結構破壞，抑制了捕光色素復合體基因的表達，降低了捕獲和傳遞光子能力，進而顯著影響了光合活性。

光系統Ⅱ是一個高度動態的多蛋白復合體，參與各種調節和修復過程。鹽脅迫產生的離子脅迫和滲透脅迫會使PSⅡ反應中心受到損傷，從而導致植物的光合電子傳遞效率和PSⅡ的光合活力降低[20]。PSⅡ相關蛋白CP47(PsbT)和CP43能夠結合近30個葉綠素分子從而發揮內在光捕獲功能[21]。PsbP和PsbQ是PSⅡ超復合體的外部亞基，負責協調PSⅡ的供體側和受體側的活性以及穩定PSⅡ-LHCⅡ超復合物方面具有特定且重要的作用[22]，也是維持水的光解反應所必需的。Psb28可能參與了PSⅡ損傷修復，影響PSⅡ-LHCⅡ超級復合物的組裝和穩定性[23]。Psb27是PSⅡ重要的組裝修復因子之一，可使Mn與PSⅡ放氧復合體OEC更容易結合[24]。在本研究中，PSⅡ相關蛋白基因PsbT、PsbP、PsbQ、Psb27、Psb28在高濃度NaCl脅迫下均下調表達，而在低濃度NaCl脅迫下表達無顯著差異，表明高濃度NaCl脅迫影響了PsbT、PsbP、PsbQ、Psb27、Psb28的表達，降低了PSⅡ電子傳遞效率，進而降低了光合速率。而低濃度NaCl脅迫對PSⅡ相關蛋白基因的影響不明顯。

PSⅠ中的PsaN是真核綠藻和植物PSⅠ所特有，也是PSⅠ唯一位于類囊體腔側的膜外在亞基。PsaD對于PSⅠ-LHCⅠ復合物的正確組裝非常必要，如擬南芥中PsaD含量降低會導致PSⅠ復合物成比例的下降[25]。鐵氧還蛋白系統是葉綠體光驅動電子傳輸、將還原力輸出到細胞質和NADP+生成的調節器[26]。葉綠體類囊體膜上的F型ATP合酶在質子電化學梯度的作用下，利用底物ADP和Pi合成ATP。在本研究中，PSⅠ相關蛋白基因PsaN和PsaD、鐵氧還蛋白基因petF以及F型ATP合酶基因ATPδ、ATPγ和ATPε在高濃度NaCl脅迫下均下調表達，但在低濃度NaCl脅迫下表達無顯著差異。這表明高濃度NaCl脅迫可顯著影響PSⅠ相關蛋白基因的表達，降低了PSⅠ電子傳遞效率，而低濃度NaCl脅迫對PSⅠ相關蛋白基因的影響不明顯。

3.3 NaCl脅迫對寧夏枸杞卡爾文循環相關基因差異表達的影響

葉綠體中依賴NADP的蘋果酸脫氫酶(MDH)能夠平衡葉綠體中ATP/NADPH比例的穩定[27]。葉綠體型果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)是卡爾文循環中的關鍵酶之一，參與CO2接受體再生的反應，催化果糖-1,6-二磷酸生成果糖-6-磷酸，并且也參與葉綠體中淀粉的合成[28]。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性水平與卡爾文循環的運轉速率有關[29]，寧夏枸杞葉片中GAPDH的活性也隨著NaCl脅迫程度的增加而顯著下降[30]。Rubisco是卡爾文循環中最重要的限速酶，可催化植物光合作用中CO2的固定，逆境脅迫引起的Rubisco活性下降會使1,5-二磷酸核酮糖和3-磷酸甘油的含量下降并抑制無機磷的再生，進而影響光合作用[31]。本研究發現，NaCl脅迫可誘導寧夏枸杞MDH、FBP、rbcS和GAPDH下調表達，而且Rubisco活性和葉片凈光合速率逐漸下降。由于高濃度NaCl脅迫破壞了寧夏枸杞葉綠體結構[19]，可能通過影響光合色素平衡和光反應系統的穩定，誘導卡爾文循環相關基因下調表達，相關蛋白(酶)表達量下降，卡爾文循環代謝活性降低，進而影響光合作用。

綜上所述，NaCl脅迫條件下，寧夏枸杞葉片中的葉綠素含量下降，凈光合速率和Rubisco活性亦下降，大部分光合作用相關差異基因下調表達。寧夏枸杞通過光合作用相關基因的差異表達，參與調控光合活性以響應NaCl脅迫(圖7)。

圖7 寧夏枸杞響應NaCl脅迫的光合作用相關基因差異表達調控網絡Fig.7 Regulatory network of photosynthesis-related differential genes in L. barbarum under NaCl stress