NK細胞及其受體表達與再生障礙性貧血的相關性研究

孔令環,王雪野,邢明雨,呂作福,艾英莉,邵萬艷,魏灼如

(吉林省人民醫院，吉林 長春130021)

再生障礙性貧血(AA)是一種由多種原因引起的造血功能衰竭綜合征，近年來被國內外研究者定義為一種涉及免疫機制異常所導致的自身免疫性疾病[1-2]，免疫細胞如T細胞、自然殺傷細胞(NK)的平衡紊亂及分泌的造血負調控因子誘導了造血干/祖細胞的異常損傷和凋亡，引起造血衰竭，是再生障礙性貧血發生的重要原因。本研究利用流式細胞術對重型再生障礙性貧血(SAA)病人及非重型再生障礙性貧血(NSAA)病人外周血NK細胞數量及功能變化的研究，探討NK細胞在AA發病機制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象2017年6月至2020年2月吉林省人民醫院血液科收治再生障礙性貧血病人初治28例(重型(SAA)9例，非重型(NSAA)19例)，其中男12例，女16例，年齡14-86歲，中位年齡61歲。按照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》(第3版)[3]，符合再生障礙性貧血的診斷標準。同時，選擇本院健康志愿者18例為對照組，男8例，女10例，年齡27-58歲，中位年齡45歲；所有檢測均知情同意。

1.2 檢測方法受試者清晨空腹靜脈采血2 ml，EDTA抗凝。采用微量全血免疫熒光技術標記NK細胞，6 h檢測完畢。抗體為Beckman Coulter 公司鼠抗人CD3-ECD、CD56-PC5、CD16-PC5、CD314(NKG2D)-FITC、CD159((NKG2A)- PE、顆粒酶granzymeβ-PE、穿孔素 perforin-FITC，破膜劑及溶血劑。常規方法標記細胞后用Beckman Coulter公司EPICS-XL型流式細胞儀，應用EXPO32ADCXL4 Color軟件分析，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，分析10000個細胞，結果以百分率表示。本試驗檢測的NK細胞包括CD16dimCD56bright亞型和CD16brightCD56dim亞型。同時常規進行T淋巴細胞亞群的檢測。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 AA病人外周血NK細胞數量及受體表達的變化(表1)

SAA組病人外周血NK細胞數，NKG2D，NKG2A，顆粒酶表達減少，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；穿孔素表達與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

NSAA組病人外周血NK細胞數，NKG2D，顆粒酶表達減少，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；NKG2A和穿孔素表達與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

SAA組病人外周血NK細胞抑制性受體NKG2A表達增加，與NSAA組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 AA病人外周血NK細胞數量及受體表達的變化

2.2 AA病人NK細胞及其受體表達與造血指標的相關性分析

NSAA病人活化性受體NKG2D表達與血紅蛋白含量(r=0.979，P=0.007)、血小板數(r=0.943，P=0.018)有相關性；顆粒酶表達與血紅蛋白含量(r=0.942，P=0.018)、網織紅細胞(r=0.906，P=0.029)有相關性；NK數量，NKG2A,穿孔素表達與白細胞、血紅蛋白、血小板、網織紅細胞等造血指標無相關性。

SAA病人NK細胞胞漿穿孔素表達與網織紅細胞數有相關性(r=0.907，P=0.046)；NK數量，NKG2D，NKG2A,顆粒酶表達與白細胞、血紅蛋白、血小板、網織紅細胞等造血指標無相關性。

2.3 AA病人外周血T淋巴細胞亞群的變化(表2)

NSAA組病人CD3+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞比例增高，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；SAA組病人CD4+T淋巴細胞減低，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；SAA組病人B淋巴細胞比例增高，與對照組差異有統計學意義(P<0.05)，與NSAA組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

SAA組與NSAA組比較，CD3+T淋巴細胞比例減低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 AA病人NK細胞與T淋巴亞群的相關性分析

NSAA病人NK細胞的活化性受體NKG2D表達與CD3+T淋巴細胞(r=0.984，P=0.005)有相關性；NK細胞的胞漿顆粒酶表達與CD3+T淋巴細胞(r=0.865，P=0.042)，CD8+T淋巴細胞(r=0.928，P=0.022)，CD4+/CD8+(r=0.942，P=0.018)、B淋巴細胞(r=-0.877，P=0.038)有相關性；其他指標沒有相關性。

表2 AA病人外周血T淋巴細胞亞群的變化

SAA病人NK細胞數與CD4+T淋巴細胞有相關性(r=0.988，P=0.006)，其他指標沒有相關性。

3 討論

目前為止，AA的病因和發病機制尚沒有完全清楚，國內外研究[4-5]已經證實，T淋巴細胞免疫異常是AA發病機制之一；林贈華等報道[6],免疫介導的再生障礙性貧血小鼠模型的研制，以及Young等[7]的研究也證明T 淋巴細胞的異常活化和功能亢進造成的骨髓損傷在原發性獲得性AA發病機制中占主導地位。本研究發現NK細胞在AA疾病進程中也起到重要作用。

NK細胞是機體免疫系統的重要組成部分，通過與DC、T細胞、B細胞相互作用，不僅調解固有免疫應答，而且參與調解獲得性免疫應答，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁[8]。NK細胞與T細胞的相互作用是通過膜上CD16、CD56與Th細胞膜上CD4發生免疫黏附[9]，同時激活巨噬細胞釋放IL-1，使Th細胞激活，活化的Th細胞分泌IL-2，IFN-γ等，促進CTL細胞分化成熟，從而增強T細胞的免疫效應。NK細胞還可以通過DC細胞間接激活Th1細胞[10]。

T淋巴細胞主要參與細胞免疫，其數量及比例關系在體內處于相對穩定狀態。本研究中，NSAA組病人抑制性CD8+T淋巴細胞比例增高，SAA組病人輔助性CD4+T淋巴細胞比例減低，都引起CD4+/CD8+比例失衡，T淋巴細胞免疫異常，引起造血細胞的免疫損傷，骨髓衰竭，引起血細胞減少，與報道一致[11-12]。本研究還發現，NSAA組病人NK細胞的NKG2D、顆粒酶表達與CD3+T淋巴細胞有相關性，SAA組病人NK細胞數與輔助性CD4+T淋巴細胞有相關性，可以認為NK細胞間接參與了造血調控。

本研究中，無論SAA組或NSAA組病人外周血NK 細胞數量均低于對照組(P<0.05)，同金夢迪等[13-15]報道一致。NK細胞通過自身表面的活化性和抑制性受體，調節自身的細胞毒性。NKG2D是最重要的活化性受體之一，本研究中，SAA組和NSAA組病人外周血NK細胞活化性受體NKG2D表達均低于對照組，殺傷功能減弱；NK細胞的第二種殺傷途徑是細胞毒作用，NK細胞的細胞毒作用的發揮主要依賴于細胞溶解蛋白(如穿孔素和顆粒酶)的產生和釋放[16-17]，本研究中SAA組和NSAA組病人外周血NK細胞胞漿顆粒酶表達均明顯低于對照組，細胞毒作用減低。以上綜合因素導致NK細胞對DC的殺傷作用減弱[18]，引起T細胞異常激活，分泌大量造血負調控因子IFN-γ等，引起骨髓造血衰竭，導致AA的發生。

本研究發現，NK細胞與造血指標有相關性。NSAA組病人的NK 細胞活化性受體NKG2D和顆粒酶表達與血紅蛋白含量有相關性；NKG2D表達與血小板數有相關性；顆粒酶表達與網織紅細胞有相關性。SAA組病人NK細胞胞漿穿孔素表達與網織紅細胞有相關性。所以，臨床AA的治療方案可以考慮通過提高NK細胞活性來提升造血指標，與Liu 等[19]報道一致，外周血 NK 細胞及其亞群在初治 SAA 病人中均低于正常對照組，IST 治療后均升高，尤其以 CD56bright NK 細胞亞群變化最明顯，且這些變化與 SAA 病人的造血恢復情況呈正相關；因此有研究者[20]提出 NK 細胞參與了 SAA 的發生、發展，但其并非起“致病”性作用，而有可能起“保護”性作用。

SAA組病人外周血NK細胞抑制性受體NKG2A表達高于對照組，也高于NSAA組。抑制性受體NKG2A表達高，代表NK細胞識別能力增強，不確定與SAA組病人的急、重等臨床癥狀是否相關，有待進一步研究。另外，SAA組病人B淋巴細胞明顯高于NSAA組，也高于對照組，體液免疫是否參與了SAA的疾病進程也有待下一步研究。

通過NK細胞與T淋巴細胞亞群及各造血指標的相關性分析，可以認為NK細胞直接或間接參與了骨髓造血調控，與造血干/祖細胞的異常損傷和凋亡相關，是再生障礙性貧血發生的重要環節。