幽門螺桿菌感染相關(guān)胃癌組織蛋白質(zhì)組特征研究

孫佳萌，劉 震，黃永勝，孫海丹，郭正光，康維明*，孫 偉*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系，北京100005;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基本外科，北京100730)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori，Hp)是一種螺旋形、革蘭染色陰性，微需氧、鞭毛狀的細(xì)菌，能夠形成生物膜，并可以從螺旋狀轉(zhuǎn)化為球狀[1]。Hp 感染是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，感染Hp的患者發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)比未感染者高3倍左右，胃癌患者Hp陽(yáng)性率為75%-95%[2-3]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將 Hp歸類為 “I類”致癌因子[4]。但在一些情況下，在胃癌患者中未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于Hp感染的證據(jù)，這就提示在胃癌中存在Hp陰性胃癌[5]。

王炯等[6]通過(guò)對(duì)現(xiàn)有有關(guān)Hp陰性胃癌的研究成果進(jìn)行總結(jié)分析后發(fā)現(xiàn)，與Hp陽(yáng)性胃癌相比，Hp陰性胃癌患者的腫瘤惡行程度更高，預(yù)后更差。同樣地，TSAI等[5]通過(guò)回顧性分析Hp陽(yáng)性與Hp陰性的胃癌案例，發(fā)現(xiàn)Hp陰性胃癌患者的預(yù)后較差，且Hp陰性狀態(tài)是胃癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但也有研究指出Hp的感染能夠通過(guò)影響某些RNA的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而影響患者的預(yù)后情況[7]。目前關(guān)于不同Hp感染狀態(tài)胃癌的研究還很少，還缺乏對(duì)二者差別的相關(guān)組學(xué)分析。

腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的主要特征之一,可使腫瘤的生長(zhǎng)速度、侵襲與轉(zhuǎn)移、藥物敏感性、預(yù)后等各方面產(chǎn)生差異。腫瘤異質(zhì)性包括瘤內(nèi)異質(zhì)性和瘤間異質(zhì)性，其組織病理學(xué)特征不同，分子特征也各異，其已知胃癌具有高度的腫瘤間異質(zhì)性[8-9]，但胃癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性研究相關(guān)報(bào)道還很少。

近年來(lái)，組學(xué)及相關(guān)技術(shù)迅速發(fā)展，在臨床生物學(xué)的研究中逐漸得到了廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的組成變化及規(guī)律，是理解基因功能的重要方法之一[10]。基于質(zhì)譜的高通量和高精度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使得蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中得到廣泛研究，目前已應(yīng)用于胃癌[11-12]等癌癥疾病的研究。

目前，對(duì)于胃癌的腫瘤異質(zhì)性和Hp感染相關(guān)胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)報(bào)道很少。本研究將通過(guò)最新的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分析胃癌腫瘤異質(zhì)性以及Hp陽(yáng)性與Hp陰性胃癌蛋白質(zhì)組差異，將有助于了解與Hp相關(guān)胃癌的蛋白質(zhì)組特征，為今后尋找更高敏感性和特異性的新的治療方法、提高患者的生存率提供了新的途徑和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：十二烷基硫酸鈉(SDS，USB公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，拜爾迪公司),二硫蘇糖醇(DTT，INALCO SpA公司)，碘乙酰胺(IAM，拜爾迪公司)，丙酮(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，胰蛋白酶(Trypsin，華利世科技公司)，水(質(zhì)譜級(jí))

研究對(duì)象：選取2019年就診于北京協(xié)和醫(yī)院的胃癌受試者，通過(guò)C13呼氣實(shí)驗(yàn)和病理切片HE染色確認(rèn)胃癌患者Hp的感染狀態(tài)，選取Hp陽(yáng)性患者和Hp陰性患者各1例，經(jīng)外科手術(shù)切除腫瘤組織，收集患者的腫瘤組織不同部位標(biāo)本各3個(gè)，相應(yīng)地在距離腫瘤位置大約5 cm處取癌旁組織不同部位各3個(gè)，將采集的組織樣本存放于-80℃冰箱冷凍保存。參與本研究的患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1蛋白質(zhì)提取和酶解 取組織樣本剪碎后加入裂解液(2% SDS,20 mM Tris,pH 8.0)，經(jīng)超聲助溶后離心去除未溶解的組織碎片。取200 μg蛋白質(zhì)依次進(jìn)行還原烷基化，加入工作濃度為10 mM DTT，95℃孵育5 min，降至室溫后加入工作濃度為55 mM IAM，室溫避光放置45 min，對(duì)暴露出來(lái)的巰基進(jìn)行封閉。采用6倍體積的預(yù)冷丙酮對(duì)還原烷基化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀，經(jīng)14 000 g離心10 min后，棄去上清，在沉淀中加入20 mM Tris對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)溶。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到經(jīng)過(guò)平衡后的30 kDa超濾膜內(nèi)套管中，酶解用FASP方法(Filter-aided sample preparation)，胰蛋白酶酶解后肽段產(chǎn)物經(jīng)SPE小柱純化，取等量肽段分別加入1 μl的質(zhì)譜時(shí)間校正肽段iRT進(jìn)行后續(xù)液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)分析。

1.2.2高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè) 利用液-質(zhì)聯(lián)用儀器對(duì)于臨床組織樣本蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物進(jìn)行差異蛋白質(zhì)分析，每個(gè)反應(yīng)上樣量為2 μg 肽段。高效液相色譜分析采用Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific公司)，液相程序60 min，流速為 800 nl/min。A相成分是含0.1% FA的水溶液，B相成分是含0.1% FA 的乙腈溶液。液相有效分離梯度設(shè)置如下：1 min B相濃度從2%升至6% B；16 min B相濃度從6%升至10% B；23 min B相濃度從10%升至20% B；8 min B相濃度從20%升至28% B；5 min B相濃度從28%升至95% B。蛋白質(zhì)組學(xué)分析采用Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)，采集模式為陽(yáng)離子模式，噴霧電壓設(shè)置為 2.3 kV，離子傳輸管溫度為 320℃。采用非依賴性數(shù)據(jù)采集方式(Data Independent Acquisition,DIA)，設(shè)置13個(gè)質(zhì)量掃描區(qū)段，一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)荷比的掃描范圍350-1300，分辨率為120000，自動(dòng)增益控制AGC參數(shù)為3e6,最大離子注入時(shí)間30 ms，二級(jí)質(zhì)譜分辨率為30000，自動(dòng)增益控制AGC參數(shù)為1e5，最大離子注入時(shí)間為45 ms。質(zhì)量隔離窗口為4Da，碰撞能量參數(shù)設(shè)置為23%，離子動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為30 ms。

1.2.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 原始數(shù)據(jù)(raw格式文件)采用Spectronaut軟件(Biognosys公司)構(gòu)建譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)樣本進(jìn)行定量分析，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)選用自2019年Uniprot 上下載的 human 數(shù)據(jù)庫(kù)。差異蛋白質(zhì)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：差異倍數(shù)(Fold Change)為2倍，同時(shí)滿足p value≤ 0.05。對(duì)于篩選出的差異蛋白質(zhì)采用Ingenuity Pathway Analysis(IPA，Biotech公司)軟件進(jìn)行生物學(xué)功能分析。對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜檢索后由Spectronaut軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用兩獨(dú)立樣本ttest檢驗(yàn)。以 p value ≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

收集Hp陽(yáng)性和陰性胃癌患者的腫瘤及癌旁組織各1例，分別取腫瘤組織和相應(yīng)癌旁組織的3個(gè)不同部位進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜DIA定量分析，在兩組樣本中共鑒定到3 8684個(gè)肽段，5 536個(gè)蛋白質(zhì)，鑒定出2個(gè)或以上肽段的蛋白質(zhì)共有3 976個(gè)，用于后續(xù)差異定量分析。

2.1 胃癌腫瘤空間異質(zhì)性分析

將Hp陽(yáng)性與陰性腫瘤組織不同部位鑒定到的蛋白兩兩進(jìn)行差異分析，以此來(lái)評(píng)估胃癌腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性。根據(jù)Hp+與Hp-不同部位腫瘤組織蛋白數(shù)據(jù)分布顯示(圖1)，T1/T2、T1/T3、T2/T3各組中差異倍數(shù)過(guò)大(log2FoldChange<-2或log2FoldChange>2)的蛋白在Hp陽(yáng)性分別占全部蛋白的2.7%(139/5 225)、2.4%(127/5 227)、2.4%(127/5 228)，在Hp陰性中分別占全部蛋白的4.4%(228/5 194)、5.0%(260/5 195)、5.7%(295/5 220)，即胃癌腫瘤內(nèi)存在一定的異質(zhì)性。

將上述蛋白進(jìn)行功能比較分析(圖1)，IPA分析結(jié)果顯示，這些蛋白在能量代謝、細(xì)胞增殖與侵襲、細(xì)胞生存與死亡、免疫應(yīng)答反應(yīng)、病毒感染等相關(guān)通路的激活與抑制具有顯著性差異。

在Hp陽(yáng)性中，與能量代謝相關(guān)通路，如磷脂代謝、鞘磷脂代謝、固醇類的合成等具有顯著差異；與細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)通路，如腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)具有明顯差異；與細(xì)胞存活與死亡相關(guān)通路，如細(xì)胞壞死、凋亡、自噬等功能都具有顯著性差異，同時(shí)細(xì)胞活力與存活也具有顯著性差異；與免疫應(yīng)答相關(guān)通路，如活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生及數(shù)量、細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等都差異顯著，Hp感染的患者機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)發(fā)生了變化；與蛋白質(zhì)有關(guān)通路，如蛋白質(zhì)的翻譯具有顯著差異性，也就是說(shuō)Hp感染的胃癌腫瘤可能會(huì)通過(guò)影響蛋白的翻譯進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)；與病毒感染相關(guān)通路，如HIV等RNA病毒感染具有顯著性差異。相比于Hp陽(yáng)性，在Hp陰性中，與細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)通路，如腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)遷移以及侵襲等具有差異性顯著；與免疫應(yīng)答反應(yīng)等相關(guān)通路，如與白細(xì)胞的結(jié)合、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有顯著性差異；與蛋白質(zhì)有關(guān)通路，如蛋白質(zhì)的產(chǎn)生以及轉(zhuǎn)運(yùn)差異性顯著，未感染Hp的胃癌腫瘤可能會(huì)通過(guò)影響蛋白的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)。因此，胃癌腫瘤組織內(nèi)異質(zhì)性的存在可能影響了蛋白的表達(dá)，而且在Hp陰性和Hp陽(yáng)性中影響的通路和功能不盡相同。

圖1 a.Hp陰性與Hp陽(yáng)性腫瘤組織內(nèi)差異倍數(shù)過(guò)大蛋白數(shù)據(jù)分布散點(diǎn)圖。縱坐標(biāo)Value表示log2FoldChange。b.Hp陰性與Hp陽(yáng)性腫瘤組織差異倍數(shù)過(guò)大蛋白的功能比較分析。顏色深淺表示p value大小，顏色越深表示差異越顯著(p value<0.05具有顯著性差異)。

2.2 胃癌與癌旁蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析

將鑒定到的3 976個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行差異定量分析，Hp陰性和陽(yáng)性的腫瘤組織與其各自的癌旁組織相比，按照上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，在Hp陽(yáng)性患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)1 843個(gè)蛋白的表達(dá)量與癌旁組織相比，發(fā)生改變，其中有1 049個(gè)蛋白上調(diào)，794個(gè)蛋白下調(diào)；在Hp陰性患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)1 630個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生變化，其中有703個(gè)上調(diào)差異蛋白，927個(gè)下調(diào)差異蛋白(表1和圖2)。因此，無(wú)論是否感染Hp，胃癌的腫瘤組織蛋白質(zhì)組特征與癌旁組織蛋白質(zhì)組特征具有顯著差異。

表1 質(zhì)譜分析篩選的差異表達(dá)蛋白數(shù)目

圖2 a.Hp陽(yáng)性腫瘤與癌旁差異表達(dá)蛋白火山圖。b.Hp陰性腫瘤與癌旁差異表達(dá)蛋白火山圖。c.Hp陽(yáng)性與陰性的腫瘤與相應(yīng)癌旁組織差異表達(dá)蛋白功能分析。顏色深淺表示z score大小，紅色表示具有正相關(guān)性，藍(lán)色表示具有負(fù)相關(guān)性，顏色越深表示相關(guān)性越強(qiáng)。

之后對(duì)上述差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分析(圖2)。IPA分析結(jié)果表明，無(wú)論Hp的感染狀態(tài)如何，胃癌的腫瘤組織與癌旁組織相比，與免疫應(yīng)答反應(yīng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存與死亡、細(xì)胞增殖侵襲有關(guān)功能發(fā)生變化。IPA結(jié)果顯示，與免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)功能，如細(xì)胞脫顆粒、細(xì)胞吞噬作用、細(xì)胞免疫反應(yīng)等都具有顯著激活趨勢(shì)，機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)增強(qiáng)；與細(xì)胞遷移相關(guān)功能，如腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)遷移、白細(xì)胞的移動(dòng)遷移等細(xì)胞移動(dòng)和遷移通路也被明顯激活，體內(nèi)細(xì)胞活動(dòng)加強(qiáng)；與細(xì)胞存活死亡相關(guān)功能，如腫瘤細(xì)胞壞死以及凋亡相關(guān)通路具有顯著抑制的趨勢(shì)，細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率整體增加，在Hp陽(yáng)性中細(xì)胞自噬功能被激活而在Hp陰性中細(xì)胞自噬被抑制；與細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)功能，如腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲通路具有顯著激活的趨勢(shì)。

2.3 Hp陰性與Hp陽(yáng)性胃癌蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析

通過(guò)差異定量分析(表1和圖3)，在腫瘤組織中，Hp陽(yáng)性與Hp陰性相比，共有764個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生變化，其中有407個(gè)差異蛋白上調(diào)，有357個(gè)差異蛋白下調(diào)。因此，Hp陽(yáng)性與Hp陰性兩種胃癌腫瘤組織蛋白質(zhì)組特征具有顯著差異。

對(duì)Hp陽(yáng)性與Hp陰性差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分析(圖3)，IPA結(jié)果顯示，兩者的腫瘤組織的差異表達(dá)蛋白與細(xì)菌生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞存活與死亡、細(xì)胞增殖侵襲等功能有關(guān)。

圖3 a. Hp陽(yáng)性與Hp陰性胃癌腫瘤組織差異表達(dá)蛋白火山圖。b. Hp陽(yáng)性與Hp陰性胃癌腫瘤組織差異表達(dá)蛋白功能分析。顏色深淺表示z score大小，紅色表示具有正相關(guān)性，藍(lán)色表示具有負(fù)相關(guān)性，顏色越深表示相關(guān)性越強(qiáng)。c. Hp陽(yáng)性與Hp陰性胃癌腫瘤差異表達(dá)蛋白相關(guān)通路比較分析。橫坐標(biāo)表示-log(p value)。

功能分析(圖3)結(jié)果表明，在腫瘤組織中，Hp陽(yáng)性胃癌患者體內(nèi)與細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)功能發(fā)生變化，如細(xì)菌生長(zhǎng)通路被顯著激活，而與細(xì)菌殺死有關(guān)通路被顯著抑制。Hp陽(yáng)性較Hp陰性胃癌，機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)受到顯著抑制作用，尤其是與細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)、白細(xì)胞遷移、細(xì)胞免疫反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)等功能受到重要影響。細(xì)胞遷移功能如腫瘤細(xì)胞系的移動(dòng)遷移在Hp陽(yáng)性中明顯增強(qiáng)，但其他細(xì)胞的移動(dòng)遷移如白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞等具有免疫功能的細(xì)胞在Hp陽(yáng)性中被顯著抑制，從而導(dǎo)致Hp陽(yáng)性患者機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)降低，與上述結(jié)論互為一致。同時(shí)在Hp陽(yáng)性患者體內(nèi)，細(xì)胞壞死、腫瘤細(xì)胞系死亡通路被抑制，細(xì)胞凋亡增加，腫瘤細(xì)胞系活力以及細(xì)胞存活率大大升高，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力也較Hp陰性大大增強(qiáng)。

通路分析(圖3)結(jié)果表明，Hp陽(yáng)性與Hp陰性的腫瘤組織相比，LXR/RXR激活通路差異最為顯著，其次為急性期反應(yīng)信號(hào)通路，與腫瘤相關(guān)經(jīng)典信號(hào)通路如PI3K/AKT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、ERK/MAPK信號(hào)通路、PTEN信號(hào)通路、蛋白激酶A(PKA)信號(hào)通路、腫瘤微環(huán)境通路、PD-1,PD-L1癌癥免疫治療通路等都具有差異，與機(jī)體能量代謝相關(guān)通路如脂肪酸β氧化、氧化磷酸化等都發(fā)生變化，免疫與炎性信號(hào)通路如IL-8信號(hào)、B細(xì)胞受體信號(hào)等也具有差異性。

3 討論

通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者無(wú)論是否感染Hp，其腫瘤組織與癌旁組織相比，蛋白質(zhì)組學(xué)特征差異顯著，腫瘤組織與癌旁正常組織具有實(shí)質(zhì)性區(qū)別，腫瘤組織中的蛋白表達(dá)量發(fā)生明顯變化；這些差異表達(dá)蛋白使得患者體內(nèi)一些信號(hào)通路以及功能發(fā)生改變，其中主要與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、存活、死亡以及免疫應(yīng)答等相關(guān)信號(hào)通路和功能相關(guān)。之后比較了Hp不同感染狀態(tài)下腫瘤組織的差異性，分析結(jié)果表明Hp陽(yáng)性胃癌較Hp陰性胃癌，其腫瘤組織中的蛋白表達(dá)發(fā)生顯著改變，也就是說(shuō)這是兩個(gè)不同的腫瘤實(shí)體，PI3K/AKT、VEGF、PTEN等信號(hào)通路在兩者中也具有差異，體內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、存活、死亡、免疫應(yīng)答等功能發(fā)生變化。

3.1 胃癌腫瘤異質(zhì)性

胃癌是一種復(fù)雜的、異質(zhì)性的疾病，先前已有研究指出不同個(gè)體間腫瘤異質(zhì)性顯著，但胃癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性鮮有報(bào)道，在本研究中我們?cè)u(píng)估了胃癌腫瘤組織樣本的瘤內(nèi)異質(zhì)性問(wèn)題。由于Hp陰性胃癌病例較為罕見(jiàn)，樣本收集較為困難，所以本研究的病例數(shù)受到限制。為了增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，收集樣本時(shí)取Hp陽(yáng)性胃癌與Hp陰性胃癌患者腫瘤及癌旁組織的3個(gè)不同部位，作為三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，然后對(duì)其三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的結(jié)果取平均值進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。腫瘤異質(zhì)性不僅可以影響診斷，同時(shí)也對(duì)治療、療效和疾病監(jiān)測(cè)、耐藥性和預(yù)后等產(chǎn)生影響，其與臨床診治密切相關(guān)，是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診療和攻克腫瘤的重大挑戰(zhàn)。

通常腫瘤異質(zhì)性會(huì)影響某些基因的表達(dá)，胃癌的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性在HER2基因背景下研究較多。Ryosuke Tajiri MD等人[13]利用免疫組化和熒光原位雜交聯(lián)合分析，在51例HER2擴(kuò)增的癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有41%的HER2擴(kuò)增腫瘤存在HER2擴(kuò)增的瘤內(nèi)異質(zhì)性。Wanjing Feng等[14]通過(guò)使用突變等位基因腫瘤異質(zhì)性(MATH)評(píng)估了胃癌患者的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，結(jié)果顯示高瘤內(nèi)異質(zhì)性較低瘤內(nèi)異質(zhì)性具有較差的預(yù)后及生存率。Phillip Stahl等[15]在研究胃癌中HER2、EGFR、CCND1和MYC基因擴(kuò)增的異質(zhì)性時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤間異質(zhì)性會(huì)影響這些基因的擴(kuò)增狀態(tài)，但是在單個(gè)轉(zhuǎn)移瘤中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明確的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。以上研究均顯示胃癌腫瘤存在異質(zhì)性并且會(huì)影響一些基因的表達(dá)，但是對(duì)于胃癌瘤內(nèi)異質(zhì)性各研究結(jié)果并不一致。根據(jù)我們目前的了解，暫無(wú)有關(guān)腫瘤異質(zhì)性影響蛋白表達(dá)的報(bào)道。在本研究中，將Hp陰性與Hp陽(yáng)性的腫瘤組織兩兩進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示，無(wú)論是Hp陰性還是Hp陽(yáng)性，其腫瘤組織內(nèi)蛋白的表達(dá)變化情況都有差別，存在腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，并且影響蛋白的表達(dá)情況。并且功能分析顯示，蛋白產(chǎn)生、翻譯及轉(zhuǎn)運(yùn)等功能受到影響，更進(jìn)一步證實(shí)胃癌腫瘤異質(zhì)性會(huì)影響蛋白的表達(dá)。

3.2 胃癌腫瘤與癌旁組織蛋白質(zhì)組學(xué)特征差異顯著

先前胃癌的組學(xué)研究主要集中于基因組的改變，近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，胃癌的蛋白質(zhì)組研究可以提供更全面的基因表達(dá)水平及相應(yīng)蛋白水平的變化情況。就胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)方面而言，目前對(duì)它的理解還只是初步的。近年來(lái)兩項(xiàng)對(duì)胃癌的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究值得我們關(guān)注。Sai Ge等[16]收集了84例彌漫性胃癌患者的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)腫瘤組織與癌旁組織的基因產(chǎn)物具有明顯差別，通過(guò)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)可以將胃癌的腫瘤組織與癌旁進(jìn)行明顯區(qū)分，并將胃癌組織分為三個(gè)亞型，分別與細(xì)胞周期失調(diào)、EMT過(guò)程、免疫應(yīng)答過(guò)程相關(guān)。還有一項(xiàng)來(lái)自韓國(guó)的關(guān)于彌漫型胃癌的大規(guī)模隊(duì)列的蛋白基因組研究[17]，Mun等人收集了80例患有彌漫型胃癌的年輕人群的配對(duì)的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織以及血液樣本，進(jìn)行了全蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組、N-糖基化蛋白質(zhì)組分析。通過(guò)整合各蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)以及基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃癌的腫瘤組織與癌旁組織相比，在基因、RNA、蛋白質(zhì)水平都發(fā)生了顯著變化，同樣利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)可以將胃癌進(jìn)行分子分型，這些亞型分別與增殖、免疫反應(yīng)、代謝和侵襲相關(guān)。以上兩項(xiàng)研究結(jié)果均證實(shí)胃癌腫瘤組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)組學(xué)特征具有顯著差異，可以根據(jù)蛋白質(zhì)組特征區(qū)分胃癌腫瘤組織和癌旁組織。

同樣在本研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)胃癌腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行了分析，蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果可以將胃癌腫瘤組織與癌旁組織很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)，蛋白質(zhì)組特征差異顯著。并且對(duì)腫瘤組織和癌旁組織的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分析，機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)、細(xì)胞增殖侵襲遷移以及細(xì)胞存活與死亡等功能都受到影響。之前的兩項(xiàng)大規(guī)模胃癌蛋白質(zhì)組研究為本研究結(jié)果提供了可靠證據(jù)，本研究結(jié)果也可作為胃癌的蛋白質(zhì)組的補(bǔ)充研究，為今后胃癌的發(fā)生發(fā)展以及診斷治療提供了更好的理解。

3.3 Hp陽(yáng)性胃癌與Hp陰性胃癌腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)特征差異顯著

為了進(jìn)一步深入研究胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，本研究中分析了感染Hp與未感染Hp的胃癌腫瘤組織的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。目前關(guān)于Hp陽(yáng)性胃癌與Hp陰性胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)特征的研究鮮有報(bào)道。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Hp陽(yáng)性與Hp陰性胃癌的腫瘤組織蛋白質(zhì)組學(xué)特征差異顯著，Hp感染狀態(tài)會(huì)對(duì)腫瘤組織的蛋白表達(dá)產(chǎn)生一定影響，這可能是兩種不同的腫瘤實(shí)體。通過(guò)對(duì)Hp陽(yáng)性和Hp陰性胃癌的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分析和通路分析發(fā)現(xiàn)，感染Hp的患者體內(nèi)與細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)通路被顯著激活，免疫應(yīng)答反應(yīng)受到抑制，具有免疫功能的細(xì)胞如白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的增殖、遷移功能均被抑制；通路分析結(jié)果顯示，PD-1，PD-L1介導(dǎo)的信號(hào)通路、腫瘤微環(huán)境、脂肪酸β氧化、氧化磷酸化等信號(hào)通路在Hp陰性和Hp陽(yáng)性胃癌中具有差異。由此推測(cè)，機(jī)體在感染Hp后可能會(huì)影響患者的生存和預(yù)后情況。

Hp是胃內(nèi)的特殊致病菌，是發(fā)生胃癌的重要因素之一，Hp的存在會(huì)影響胃內(nèi)其他菌群的定值和分布。Wang Lili等[18]通過(guò)qPCR方法測(cè)定了慢性胃炎患者和胃癌患者的胃粘膜中的細(xì)菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)胃癌患者的胃粘膜中細(xì)菌數(shù)量明顯多于慢性胃炎患者，并且還發(fā)現(xiàn)Hp的感染狀態(tài)對(duì)細(xì)菌負(fù)荷有顯著影響，Hp陽(yáng)性患者的細(xì)菌載量明顯高于Hp陰性患者，而且細(xì)菌數(shù)量與Hp的數(shù)量呈正相關(guān)，提示Hp感染是胃微生物群細(xì)菌數(shù)量的決定因素之一。因此，機(jī)體由于感染Hp可能會(huì)大大增加體內(nèi)其他細(xì)菌的生長(zhǎng)以及定值，與本研究結(jié)果顯示的細(xì)菌生長(zhǎng)通路激活以及細(xì)菌死亡通路抑制的結(jié)果是一致的。

Hp感染后會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。免疫應(yīng)答是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除病原體的過(guò)程，通過(guò)有效的免疫應(yīng)答過(guò)程，機(jī)體才能維持正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在胃癌組織中常常存在白細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)以及會(huì)分泌大量的細(xì)胞炎性因子，導(dǎo)致出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。但是從本研究結(jié)果中可以看到，患者在感染Hp后，機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)和炎癥反應(yīng)反而出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象。多項(xiàng)研究[19-21]指出，機(jī)體在感染Hp后，Hp表面的脂多糖(LPS)成分會(huì)使宿主的主要免疫機(jī)制如吞噬細(xì)胞活性等下調(diào)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞對(duì)Hp的吞噬清除作用減弱，從而減弱甚至抑制宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)LPS還會(huì)影響某些細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)如上調(diào)IL-18下調(diào)IL-1β等[20]，減弱宿主的炎癥反應(yīng)；Hp的定值可以通過(guò)調(diào)節(jié)B細(xì)胞和T細(xì)胞信號(hào)通路從而逃避宿主免疫系統(tǒng)[22]，IL-8信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路等在Hp陰性和Hp陽(yáng)性中的差異性更好的印證了這一點(diǎn)，由此可以形成一個(gè)利于Hp生長(zhǎng)的環(huán)境，促進(jìn)Hp的生長(zhǎng)增殖和定值。可能正是由于Hp表面LPS成分的存在使得宿主的免疫功能受到抑制，更加有利于Hp本身的生長(zhǎng)和定值，從而促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。PD-1，PD-L1介導(dǎo)的信號(hào)通路、腫瘤微環(huán)境通路在Hp陽(yáng)性與陰性胃癌中具有顯著差異，其在抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)以及腫瘤免疫逃逸過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用[23]。

Hp陰性與Hp陽(yáng)性胃癌組織細(xì)胞的能量代謝方式具有顯著差異。多項(xiàng)研究指出[24-26]，胃癌疾病組與對(duì)照組相比，體內(nèi)能量代謝發(fā)生失調(diào)，但在這些研究中并沒(méi)有對(duì)Hp感染狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分。René G.Feichtinger等人[27]采用免疫組化方法研究了氧化磷酸化系統(tǒng)在胃癌和胃炎中的作用，分析了Hp感染對(duì)幾個(gè)關(guān)鍵線粒體蛋白的影響，與對(duì)照組織相比，腸型胃癌組織的氧化磷酸化作用復(fù)合物發(fā)生顯著變化，并且這種變化與Hp感染無(wú)關(guān)，并推測(cè)在胃癌中發(fā)現(xiàn)的能量代謝的改變可能獨(dú)立于細(xì)菌感染發(fā)生。目前關(guān)于Hp不同感染狀態(tài)的胃癌研究還尚少。本研究結(jié)果顯示能量代謝通路如脂肪酸β氧化、氧化磷酸化等與Hp的感染狀態(tài)可能存在一定聯(lián)系，在一定程度上為當(dāng)前Hp不同感染狀態(tài)的胃癌腫瘤的能量代謝研究提供了補(bǔ)充。但由于本研究受到樣本數(shù)的限制，關(guān)于Hp感染狀態(tài)對(duì)能量代謝的影響還需擴(kuò)大隊(duì)列進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)胃癌的蛋白質(zhì)組特征研究進(jìn)行了研究，包括腫瘤異質(zhì)性、腫瘤組織與癌旁組織差異及Hp陽(yáng)性和陰性胃癌。通過(guò)本文研究發(fā)現(xiàn)，胃癌腫瘤存在異質(zhì)性，并影響蛋白表達(dá)；胃癌的腫瘤組織和癌旁組織蛋白質(zhì)組學(xué)特征差異顯著，免疫應(yīng)答反應(yīng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存與死亡、細(xì)胞增殖侵襲等功能具有差異；Hp陽(yáng)性胃癌與Hp陰性胃癌具有不同的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，腫瘤相關(guān)信號(hào)通路以及免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存與死亡、細(xì)胞增殖侵襲等功能在Hp陽(yáng)性胃癌與Hp陰性胃癌中表達(dá)也存在差異。本文研究加深了對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的理解，為進(jìn)一步進(jìn)行胃癌發(fā)病機(jī)制研究提供了新的線索，也為胃癌的治療干預(yù)和疾病預(yù)防提供了重要思路。