H19、CHI3L1在發生側頸淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌中的表達研究

任冰鈺，王 玨，胡明欣，高曉凡，丁相福*

(1.吉林大學第二醫院 甲狀腺外科，吉林 長春130041;2.吉林大學白求恩口腔醫院 修復科，吉林 長春130021)

根據癌癥統計報告，甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)是第九大最常被診斷出的癌癥[1]，居城市地區女性惡性腫瘤發生率第4位，預測將以年均20%的速率持續增長[2]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是TC中最常見的病理類型，10年生存率高達90%[3]。隨著檢出率增高，高侵襲性、分化程度差、臨床分期晚的PTC數量逐年增加，它們的復發及死亡風險較大[4]。長鏈非編碼RNA(Long Noncoding RNA，lncRNA)具有相對較高的組織器官特異性[5]，研究發現在發生側頸淋巴結轉移的PTC中lncRNA出現差異表達基因，擬為阻斷淋巴管形成、降低側頸淋巴結轉移率、提高患者生存率提供靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集3例2020年在吉林大學第二醫院病理證實為發生側頸淋巴結轉移的PTC患者的癌組織、癌旁組織、無瘤甲狀腺組織。

第1例：男性，48歲，(甲狀腺左葉)微小乳頭狀癌(直徑分別為0.3 cm、0.5 cm)，(甲狀腺右葉)微小乳頭狀癌(直徑分別為0.2 cm、0.5 cm)，右頸Ⅲ、Ⅵ區淋巴結(1/6)。

第2例：女性，27歲，(甲狀腺左葉)微小乳頭狀癌(多灶，最大直徑0.8 cm)，(甲狀腺右葉)乳頭狀癌，左側II-V區淋巴結(6/10)，左側VI區淋巴(7/12)，右側Ⅵ區淋巴結(2/2)。

第3例：女性，26歲，(甲狀腺左葉)乳頭狀癌，(甲狀腺右葉)微小乳頭狀癌，左側Ⅱ-Ⅴ區淋巴結(2/6)，左側Ⅵ區淋巴結(7/12)。

1.2 方法

1.2.1去核糖體RNA(rRNA)鏈特異性文庫測序，操作流程圖及儀器試劑如圖1所示。

圖1 rRNA鏈特異性文庫測序實驗流程

1.2.2生信分析 見圖2。

圖2 生信分析流程圖

2 結果

2.1 lncRNA表達差異分析

差異表達基因篩選標準：FDR<0.05&|log2FC|≥1。繪制出散點圖(圖3)、火山圖(圖4)。

2.2 篩選差異表達基因

見表1，圖3、圖4。

3 討論

回顧性分析發現PTC發生側頸淋巴結轉移率為20%-90%[6]。癌灶侵犯腺葉上段1/3、原發灶分期達到T3或T4、多中心病灶均為獨立的危險因素[7]。總體而言，這樣的患者預后較差[8]，死亡率高，尤其是老年患者[9]。若無影像學及穿刺病理學證實為發生側頸淋巴結轉移的PTC，否認手術不會常規清掃側頸部淋巴結。據統計，隱匿性發生側頸淋巴結轉移的PTC高達55%[10]。

圖3 差異基因可視化圖

圖4 差異基因可視化圖

淋巴結轉移與淋巴管形成密不可分，腫瘤會直接或間接刺激淋巴管生成和產生促進淋巴結轉移的生長因子[11]。淋巴管生成是惡性腫瘤細胞發生淋巴結轉移的限速步驟[12]。lncRNA被證實為多種腫瘤的驅動或抑制因子，與惡性腫瘤的發生發展、細胞凋亡過程相關[13]，影響癌癥細胞內穩態的各個方面[14]。

實驗得出lncRNA H19明顯高表達、lncRNA CHI3L1明顯低表達，以此展開討論。H19位于染色體11p15，該位點還包含胰島素樣生長因子2[15]，在胚胎發生中高表達，但出生后大多組織中幾乎檢測不到[16]。H19具有促癌和抑癌的雙向功能，證實與人類遺傳疾病和癌癥有關[16]，參與多種腫瘤的侵襲轉移過程，在肺癌[17]、乳腺癌[18]、胃癌[19]高表達，而在視網膜母細胞瘤[20]、膀胱癌[21]中低表達。Lan[22]發現H19在PTC癌組織中表達下調。Liu等發現H19表達水平明顯高于癌旁或正常組織[23-24]，H19過表達時抑制細胞周期進展，細胞增殖、遷移和侵襲性增加[23]。本實驗得出H19在癌組織、癌旁組織中均高表達，推測與腫瘤細胞增殖和侵襲相關，與發生側頸淋巴結轉移有關，擬通過構建lncRNA-H19敲除慢病毒，轉染高表達癌細胞，qPCR驗證敲減水平，進而檢測各組細胞的增殖、遷移及侵襲能力。殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase 3-like 1，CHI3L1)，也稱為YKL-40，位于染色體1q32.1，與多種惡性腫瘤相關：在結腸癌[25]、食管癌[26]、宮頸癌[27]高表達，提示侵襲性增強、預后不良，在口腔癌中高表達，提示與淋巴結轉移有關[28]。Cheng等[29]發現CHI3L1在甲狀腺良性腫瘤中呈現低表達或不表達，在甲狀腺惡性腫瘤中高表達。本實驗CHI3L1低表達考慮與側頸淋巴結轉移有關，可能也因為樣本量較少且未包含PTC亞型有關。

表1 差異表達基因

隨著全基因組和轉錄組測序技術推進和精準醫學的發展，lncRNA在多種腫瘤中出現基因表達差異，有望作為腫瘤標志物用于疾病的診斷和治療。

綜上所述，H19、CHI3L1在發生側頸淋巴結轉移的PTC中出現差異表達，推測與惡性病理特征有關，是預后不良的分子標志物，可作為靶點阻斷淋巴管形成，降低側頸部淋巴結的轉移率。