糖尿病動物模型構建的研究進展

崔 淼,朱春江,劉向榮

(長春中醫藥大學，吉林 長春130017)

糖尿病是最常見的慢性疾病之一，是由遺傳因素和環境因素共同作用引起的以持續性的高血糖以及長期代謝紊亂為主要表現的代謝綜合征。我國18歲及以上成年人糖尿病的患病率為12.8%，預計到2045年世界范圍內糖尿病的患病人數將達到7億，而死于糖尿病或是其并發癥的約有420萬人[1]，全球每年因糖尿病的相關醫療支出約為7600億美元[2]，給全球經濟帶來了巨大的負擔。糖尿病動物模型的構建，可以較好的模擬糖尿病的發生發展過程，有利于對糖尿病的病理改變及發病機制的觀察、治療藥物的篩選[3]。本文主要對糖尿病動物模型構建的相關文獻進行綜述，為以構建糖尿病模型為基礎的研究提供參考。

1 自發性糖尿病動物模型

自發性糖尿病動物模型指的是在自然條件下，因為先天性或遺傳性因素而發生糖尿病表現的動物。

1.1 1型糖尿病動物模型

1.1.1BB大鼠 BB(Bio-Breeding)大鼠是自發性1型糖尿病動物模型，是由加拿大渥太華生物培養實驗室培養而來的遠交系的動物模型，大鼠淋巴細胞中的CD8+與CD4+T細胞會自發性減少，故該型大鼠會因胰島素缺乏引起的酮血癥而導致死亡[4]，與人類1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus T1DM)的表現相似，可以作為T1DM在遺傳、免疫學等方面研究的動物模型。

1.1.2NOD小鼠 NOD小鼠 (non-obese diabetic mouse)是1974年日本大阪的實驗室用JCR-ICR品系的糖尿病小鼠雜交而來的1型糖尿病動物模型。該模型的小鼠因免疫細胞激活而導致胰島β細胞被襲擊破壞，進而呈現出糖尿病的臨床表現。不注射胰島素時，NOD小鼠僅可存活數周，但不會因酮血癥死亡，這是此種模型不同于人類1型糖尿病的情況[5]。而NOD小鼠中的MHC2類的結構與人類中的MHC2類相似，會使此種動物模型的小鼠與人類對糖尿病具有相同的抵抗力或是易感性，使NOD小鼠在糖尿病遺傳機制的研究中有重要作用[6]。

1.2 2型糖尿病動物模型

1.2.1GK大鼠 GK(Goto-Kakizaki)大鼠指的是Goto等在1975年，在白化的Wistar大鼠中挑選并培養的，是自發性和非肥胖2型糖尿病動物模型[7]。它的特點主要是胰島分泌能力低，血糖有輕度升高，其血糖升高的主要原因是胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷[8]，與人類2型糖尿病的發病機制相類似。但模型的建模時間較長且難度大，同時成活率不高，應用于研究時會受到一定限制。

1.2.2OLETF大鼠[9]OLFETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠是自發性2型糖尿病動物模型，是日本制藥公司在1984年通過雜交得到的動物模型。該模型的大鼠在早期的主要表現是胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂，晚期則可合并糖尿病腎病，與人類的2型糖尿病很相似。該模型大鼠因其膽囊收縮素A型受體(cholecystokinin type A receptor,CCKAR)的基因表達完全缺失，故大鼠常有肥胖的表現，同時，OLETF大鼠X染色體上的ODB1基因、14號染色體上的ODB2基因以及睪酮，均與2型糖尿病發病有著密切相關[10]，因此成為對糖尿病治療藥物作用機制進行研究時常用的動物模型。

1.2.3Zucker大鼠 Zucker兄弟于1961年在Zucker大鼠體內發現了“肥胖基因”fa，Zucker大鼠是2型糖尿病動物實驗中常用的肥胖大鼠模型。Zucker大鼠因基因突變，出現肥胖且伴有高胰島素血癥、高脂血癥以及中度高血壓，血糖呈輕度升高，是研究糖尿病血管病變的理想動物模型[11]。

1.2.4KK-Ay小鼠 KK小鼠是具有和人的肥胖性糖尿病相似特征的動物模型，是K.Kondo在1941年應用Kasukabe小鼠原種群培育得來的具有先天性遺傳缺陷性小鼠。因KK小鼠沒有顯著的表型特征，研究者將突變毛色基因(ay)轉入小鼠體內，形成KK-Ay小鼠。ay基因可以影響小鼠的毛發，更重要的是其可以引發代謝紊亂，導致小鼠出明顯的肥胖和高血糖等表現，而雄性小鼠的表現更為明顯，此種動物模型廣泛用于T2DM的實驗模型[12]。

1.2.5ob/ob小鼠、db/db小鼠 ob/ob (obese)小鼠和db/db(diabetes)小鼠都是屬于遺傳性肥胖2型糖尿病的動物模型，其中ob基因和db基因屬于常染色體隱性基因，兩種動物模型的小鼠均有嚴重的肥胖、多食多尿，以及高血糖等表現[13]。ob/ob小鼠的leptin(ob基因產物)缺乏，導致胰島素抵抗惡性循環的產生，db/db小鼠是因4號染色體上的瘦素蛋白受體(Lepr)基因發生突變，導致出現Lepr沉默和高胰島素血癥[14]。此兩種小鼠有助于對2型糖尿病血脂紊亂的研究及對抗糖尿病藥物的篩選。

2 實驗性糖尿病動物模型

2.1 手術誘導糖尿病動物模型

手術誘導糖尿病動物模型的方法，最早的是胰腺切除法。Minkowshi在1889年應用手術方式切除了狗的胰腺，術后狗出現多飲、多食、多尿及尿糖等糖尿病的表現，第一次成功構建了糖尿病動物模型。切除豬的胰腺后，豬的葡萄糖耐量低于正常水平，構建了糖尿病動物模型。胰腺切除術誘導的糖尿病動物模型較為穩定，但因胰腺的切除，導致胰島素絕對缺乏，動物可能會出現高血糖、酮癥酸中毒等表現，甚至動物出現死亡[4]，與此同時，手術切除進行造模過程繁瑣，術中可能損傷其他組織[15]，術后有感染等風險。

2.2 飲食誘導糖尿病動物模型

飲食誘導法一般是用高脂高糖的飼料連續喂養實驗動物，其發生的機制可能是該種飲食引發動物體內糖脂代謝紊亂，從而降低胰島素敏感性，導致出現胰島素抵抗[4]。通過給小鼠持續喂食1-20周的高脂(含有5%-60%脂肪)飲食構建糖尿病動物模型，喂食的時間主要取決于研究需要的模型病變嚴重程度。研究表明[16]，不同品種的小鼠對高脂飲食喂養的反應是存在差異的，同品種小鼠在面對高脂飲食喂養的反應也存在一定不同，即在表型上有一定差異性。在糖尿病動物模型構建過程中，需要密切監測其食物的攝入量以及體重的變化情況。除此之外，高脂飲食誘導糖尿病動物模型的構建，也受到實驗動物性別的影響。高雪等[17]研究結果表明，通過延長大鼠高脂飼料的喂養時間，能夠加重其糖尿病的腎臟損害。同時，此種方法可以作為糖尿病腦病動物模型的誘導方法[18]，廣泛用于對糖尿病并發癥的相關研究。

2.3 藥物誘導糖尿病動物模型

2.3.1鏈脲佐菌素(streptoxolocin，STZ)誘導法

STZ是一種能夠使胰島β細胞產生毒素的抗菌素，1963年首次發現其有引發糖尿病的作用，其作用機制主要是致胰腺β細胞損傷，引起胰島素分泌減少，從而出現糖尿病癥狀[19]。1976年KOLB等研究，首次發現通過靜脈或腹腔注射STZ可以誘導出糖尿病動物模型。另有研究表明，胰島的損傷程度與STZ的劑量大小呈現明顯的正相關，一方面大劑量注射STZ可使大量胰島β細胞破壞，血糖迅速升高，建模的成功率高，另一方面迅速升高的血糖易導致動物酮癥酸中毒而死亡[20]。冷昌龍等[21]分別選擇150 mg/kg和50 mg/kg兩種不同劑量的STZ，進行單次大劑量及多次連續小劑量的腹腔注射，用以構建糖尿病動物模型，結果顯示小劑量多次的STZ注射，會使動物的血糖水平升高緩慢，但呈現持續上升，并維持在較高的水平。研究顯示[22]，雄性動物的糖尿病動物模型成模率高于雌性動物，且糖尿病動物模型中糖的代謝紊亂程度，亦是雄性大鼠高于雌性大鼠，故在糖尿病動物模型中雄性大鼠會較早出現死亡。

2.3.2四氧嘧啶(alloxan，ALX)誘導法

四氧嘧啶是一種胰島β細胞毒劑，會產生超氧自由基破壞胰島β細胞，導致胰島素缺乏，進而導致血糖過高及糖尿病的發生，此方法常用于構建1型糖尿病模型。腹腔內給藥170 mg/kg和200 mg/kg的ALX，兩個劑量構建糖尿病動物模型的成功率均在90%以上，但其死亡率不同，170 mg/kg的給藥量死亡率較低[24]。該藥物誘發糖尿病的機理與STZ相似，但四氧嘧啶所引起高血糖癥具有不穩定性及可逆性，故此種方法構建的糖尿病動物模型不能恰當的對降糖藥的作用進行評估[23]。

2.4 飲食誘導聯合STZ誘導法

高糖高脂飲食能降低動物對胰島素的敏感性，進而誘發胰島素抵抗[25]，在此基礎上注射小劑量STZ，能夠破壞部分的胰島β細胞，導致胰島素的分泌相對不足，使其更接近2型糖尿病模型[26]。應用此種建模方法，高糖高脂飲食的喂養時間及STZ的注射劑量的不同，會對建模產生不同的影響。Mansor等[27]的研究結果顯示，高脂喂養實驗動物2周后聯合25 mg/kg的STZ腹腔注射，可以構建2型糖尿病動物模型，但該模型穩定性較差，僅維持了1周。劉丹丹等[28]應用高脂飲食喂養6周聯合30 mg/kg的STZ腹腔注射，此種方法模型構建成功率為70%，且模型的穩定性有所提高，維持了2周。另有研究表明[29]，高脂飼料喂養大鼠6-8周，然后進行小劑量的STZ腹腔注射，2型糖尿病的建模成功率為79%。STZ的注射劑量會受高糖高脂飲食喂養時間的影響，給予動物高脂飲食喂養的時間越長，誘發動物的胰島素抵抗越明顯，STZ的注射劑量也就相對的減少[30]。而STZ的給藥途徑也會影響建模所需的STZ的劑量，黎婭等[31]的研究表明，高脂飲食喂養12周聯合25 mg/kg的STZ進行尾靜脈的注射，能夠成功構建2型糖尿病模型，且模型的血糖水平穩定，構建成功率較高。此種建模方法可以作為糖尿病腦病等糖尿病并發癥的構建[18]，廣泛適用于對2型糖尿病的并發癥及藥物研究。

3 基因工程糖尿病動物模型

基因工程動物模型指的是借助基因工程技術人為控制動物的基因表達，使動物獲得相應的遺傳特性，基因工程技術主要包括基因打靶技術、轉基因技術等，此技術構建的糖尿病動物模型的科學性較強，但是技術比較復雜。研究表明[32]，應用Cre/loxP DNA結合技術敲除GLUT2基因，可以構建糖尿病動物模型。應用胚胎干細胞(ES)打靶技術[33]能夠成功構建2型糖尿病動物模型。應用ES打靶技術敲除GCK基因上C57BL6J位點后的小鼠，其后代的小鼠的空腹血糖水平有顯著的增加[34]。應用ES打靶技術敲除了TCF7L2基因的小鼠，在給予高脂飲食喂養后，小鼠的胰島素敏感性受損，胰島素分泌減少[35]。IRS-1基因缺失純合子(IRS-1-/-) 的小鼠在成年后，小鼠出現胰島素抵抗、糖尿病等表現的大約在半數左右[30]。應用ZFNs技術，利用胚胎顯微鏡敲除NOD小鼠的TNFRSF9基因，能夠成功構建2型糖尿病動物模型[36]。應用CRISPR/Cas9基因編輯技術可以成功獲得基因修飾的糖尿病動物模型[37]。應用CRISPR/Cas9技術敲除鼠的瘦素受體基因，小鼠會出現體重增加、高血糖等糖尿病的癥狀[38-39]。

4 小結

綜上所述，糖尿病動物模型的構建是研究糖尿病發病機制基礎，是研究糖尿病治療藥物的關鍵環節。本文對常用的構建糖尿病動物模型方法進行分析總結，每種構建方法都具有各自的優勢及相應的局限性。自發性糖尿病動物模型短期內在糖尿病癥狀及血糖變化等方面表現不突出；實驗性糖尿病動物模型因多應用化學藥物誘導，其動物模型的建模成功率較低，而死亡率相對較高；基因工程技術的糖尿病動物模型，在構建上需要的時間較長，并且對構建模型的設備要求較高。實驗性糖尿病動物模型在目前實驗中應用較多，但在研究過程中，應根據具體的研究目的及實際的實驗條件等情況選擇合適的建模方式。在了解各種建模方式的原理基礎上，根據研究需要將各種建模技術進行適宜的組合，以提高建模的效率。