Toll樣受體在骨退行性疾病發生發展中作用機制的研究進展

黎祥濤，蘇天，溫鵬，崔紅旺

海南醫學院第一附屬醫院創傷醫學中心，海口 570102

骨退行性疾病是以一類以骨質疏松、關節軟骨退變及周圍軟組織慢性炎癥為主要特征的全身性疾病，包括椎間盤退行性變、骨關節炎和骨質疏松。隨著我國人口老齡化的進展，骨退行性病變發病率逐年上升，給家庭和社會帶來沉重負擔。由于其發病機制尚不完全清楚，治療上多以止痛、理療等對癥治療為主，治療效果欠佳。研究發現，固有免疫在骨退行性疾病發展中發揮關鍵作用。Toll樣受體（TLRs）作為固有免疫模式識別受體中的典型代表，廣泛參與病原相關分子模式（PAMPs）的識別及內源性危險信號相關分子模式（DAMPs）的感知，進而啟動固有免疫應答［1］。TLRs 大量表達于骨細胞、破骨細胞、成骨細胞表面，參與骨退行性疾病發展［2］。TLRs 傳導信號根據銜接蛋白不同可分為MyD88 依賴性和TRIF 依賴性兩種途徑，核因子κB（NF-κB）在這兩種途徑中均發揮關鍵性作用，其表達釋放出高水平的炎癥細胞因子IL-1、TNF-α、IL-6，可增加成骨細胞凋亡，同時通過B 細胞產生的NF-κB 配體受體激活劑（RANKL）間接刺激破骨細胞生成［3］。在骨組織及周圍軟組織損傷區域中，可檢測到TLRs、NF-κB 及炎癥介質表達明顯升高，并且TLRs介導的信號通路釋放炎癥介質及蛋白水解酶，調控骨細胞凋亡及周圍組織損傷過程［4］。這提示骨退行性疾病的進展可能與TLRs/NF-κB 信號通路介導的固有免疫反應有關。現將TLRs 在骨退行性疾病中的作用機制研究進展綜述如下。

1 TLRs在椎間盤退行性變發生發展中的作用機制

椎間盤退行性變是由于中央髓核和細胞外基質的蛋白聚糖分解代謝，導致椎間盤的水含量和可壓縮性降低，纖維環發生微裂和撕裂，椎間盤結構完整性受到破壞。椎間盤退行性變的病理特征是分解代謝和炎癥刺激過程，椎間盤分解代謝狀態是由椎間盤細胞產生炎癥級聯反應驅動的。TLRs 和炎癥介質在變性的椎間盤組織中呈高表達狀態，TLRs激活與椎間盤退行性變進展密切相關［5］。

既往研究顯示，椎間盤感染低毒性厭氧菌（如痤瘡桿菌）是椎間盤退變的原因之一。痤瘡桿菌能夠在人體及動物椎間盤環境中存活，并通過激活TLRs途徑誘導退行性變。體外研究顯示，加入兩種痤瘡衣原體菌株刺激椎間盤細胞后，細胞中IL-1β、IL-6、IL-8 和誘導型一氧化氮合酶mRNA 表達均顯著升高；加入TLR2/4 拮抗劑后，細胞中IL-6 mRNA 表達降低［6］。

最新研究認為，椎間盤的過度機械負荷會改變基質特性并影響椎間盤細胞代謝，從而導致退行性椎間盤疾病和椎間盤源性疼痛的發展，體外椎間盤細胞的高機械應變培養可使椎間盤細胞中TLR2、TLR4、TNFα mRNA 表達上調［7］。已有研究表明，TLR4參與中央髓核的炎癥反應，在發生椎間盤變性時其水平上調。中央髓核細胞中TLR4 的活化導致細胞生物物理性質的顯著、持久的變化，包括水力滲透性和滲透活性水含量，以及肌動蛋白細胞骨架的改 變。JACOBSEN 等［8］使 用TLR4 激 動 劑 脂 多 糖（LPS）培養從牛椎間盤中分離的中央髓核細胞，發現細胞內一氧化氮（NO）釋放增加，IL-6 mRNA 表達上調；細胞水力滲透性和細胞半徑增加，導致細胞抗壓剛度降低；利用TLR4 抑制劑TAK-242 處理細胞能減輕LPS 誘導的皮質肌動蛋白重塑和IL-6 上調，保護中央髓核細胞的機械生物學功能。但是也有研究認為，TLRs 對保持椎間盤的穩態是必須的，TLR2/絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路對于髓核細胞的細菌吞噬作用和吞噬酶體的形成至關重要［9］。

在所有細胞中，TLRs 信號通路激活的主要結果都是促炎細胞因子的產生。TLRs信號通路激活后，促炎細胞因子和蛋白水解酶的釋放可直接導致椎間盤退變。LI 等［10］報道，椎間盤退變患者手術切除的椎間盤組織中存在TLRs mRNA 表達，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 mRNA的表達量與椎間盤退變程度相關。WANG 等［11］報道，以IL-1β 或TNF-α 培養椎間盤細胞均可增加TLR1、TLR2、TLR4 mRNA 表達，并造成細胞衰老和凋亡增加；細胞凋亡率與IL-1β、TNF-α 濃度和持續時間呈正相關。由此可見，椎間盤細胞分泌的炎癥因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 與椎間盤退行性變的進展直接相關，具有促進趨化因子產生、激活TLRs和分解代謝酶分泌的協同效應。

在椎間盤退行性變過程中，基質降解的蛋白酶活性至關重要。TLRs 激活導致椎間盤組織中的基質金屬蛋白酶（MMPs）及聚蛋白多糖酶（ADAMTS）表達增加，MMPs 和ADAMTS 具有分解細胞外基質中軟骨組織構成分子的能力，如纖維連接蛋白、肽聚糖、Ⅰ型和Ⅱ型膠原等。除了上調基質降解酶外，TLRs信號通路激活還可以抑制細胞外基質合成，從而進一步加劇分解代謝［12］。GLAESER 等［13］報道，對終板軟骨細胞采用IL-1β 預刺激并進行機械負載，NF-κB mRNA 表達明顯升高，下游MMP-3、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達增加；加入NF-κB 抑制劑NEMO 寡肽與終板軟骨細胞共培養能夠增加細胞活力，并降低IL-1β 預刺激、機械負載細胞中的MMP-3 mRNA 表達水平。TLRs 是眾多理化及生物因素作用于中央髓核和細胞外基質的靶點，TLRs信號通路激活可導致異常的炎癥因子及蛋白酶的釋放引起組織破裂。因此，阻斷TLRs/NF-κB 信號通路可能為椎間盤降解提供一種潛在的降級治療方法。

2 TLRs在骨關節炎發生發展中的作用機制

骨關節炎是以軟骨和軟骨下骨變性以及滑膜炎相關為主要病理變化的慢性退行性骨關節病。固有免疫受體識別體內外危險因素后觸發軟骨和滑膜細胞的慢性炎癥反應，與骨關節炎的進展有直接關系，無菌性炎癥可由軟骨細胞釋放并激活模式識別受體的損傷相關分子模式引起［14］。TLR2和TLR4作為固有免疫識別受體TLRs家族代表，在骨關節炎發展中具有重要作用。

研究顯示，骨關節炎患者關節軟骨及滑膜組織中TLR2 和TLR4 mRNA 表達較正常組織明顯上調；并且在骨關節炎患者滑膜關節液和組織中含有能夠激活TLRs 的幾種DAMPs，包括肽聚糖、脫蛋白、S100/鈣粒蛋白家族和透明質酸等［15］。YOU 等［16］對原代培養的軟骨細胞加入透明質酸后，TLR4、MyD88、TRAF-6 mRNA 表達明顯增加，下游誘導的炎癥細胞因子及MMPs 表達升高，表明TLRs 被透明質酸識別后可激活信號通路，引起慢性炎癥和基質金屬蛋白酶釋放，引發關節軟骨的分解反應。大多數DAMPs 是由骨關節內外因素損傷所產生的軟骨或滑膜衍生物，也有一些來自于軟骨細胞衰老崩解釋放的內源性物質，如dsRNA、高遷移率族蛋白1（HMGB-1）、尿調素等。LI 等［17］向大鼠關節腔內注射HMGB-1 構建關節炎模型，發現HMGB-1 可激活TLR4/NF-κB 信號通路，導致軟骨組織中MMP-13、ADAMTS5、IL-1β、IL-6 mRNA表達上調，引起關節軟骨破壞、軟骨下骨變性和滑膜炎；而對TLR4 和Myd88 基因敲除大鼠進行同樣的試驗，發現軟骨組織中MMP-13、ADAMTS5、IL-1β、IL-6 mRNA 表達受到明顯抑制。

研究發現，骨關節炎患者軟骨組織中TLR7 mRNA 表達顯著高于健康受試者；向軟骨細胞中加入TLR4 激活劑LPS 共培養后，TLR7 mRNA 表達顯著提高，MMP-3、MMP-13 表達上調，半胱天冬酶3 和Bax 凋亡蛋白表達增加，促進軟骨細胞凋亡和基質降解；加入TLR7 抑制劑siRNA 轉染軟骨細胞后，LPS 刺激軟骨細胞中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表達顯著下降，緩解LPS 誘導的細胞凋亡和ECM 降解［18］。此外，STOLBERG 等［19］對人類和小鼠軟骨組織進行RT-PCR 檢測發現，TLR3、TLR9 也在軟骨組織中表達；通過小鼠關節腔內注射環孢素G 構建骨關節炎模型發現，與野生型小鼠相比TLR3 和TLR9敲除顯著降低了小鼠軟骨細胞凋亡和軟骨基質降解，減少滑膜中IL-1β、TNF-α 炎癥浸潤，減緩了骨關節炎的進展長達8周。

脂多糖結合蛋白LBP和CD14是TLRs的輔助分子，對于低度炎癥引起的創傷后骨關節炎軟骨破壞是必需的。動物實驗顯示，向小鼠關節腔內注射TLR2/4 激活劑LPS 后，與野生型小鼠相比，LBP 和CD14 基因敲除小鼠軟骨中IL-1β、IL-6 和ADAMTS5 mRNA 表達受到抑制，有效緩解了軟骨破壞和滑膜炎［20］。可見，TLRs介導的信號通路參與骨關節炎軟骨凋亡和滑膜變性的過程，對組織修復和關節結構破壞具有重要作用。因此，以TLRs及其介導的信號通路上作用元件、輔助因子、下游炎癥介質等為靶點進行干預，最終達到骨關節炎的緩解甚至治愈，成為骨關節炎預防及治療的新趨勢。

3 TLRs在骨質疏松癥發生發展中的作用機制

骨質疏松癥的特征是骨密度低，骨小梁微結構退變，骨脆性增強和骨折易感性增加，尤其在絕經后婦女中更常見。雌激素缺乏是絕經后骨質疏松發生的直接原因，當雌激素不足時，骨合成代謝和抗破骨作用減少，導致持續的骨破壞引起骨質疏松。此外，絕經后婦女免疫狀態的改變也間接導致骨破壞［21］。崔紅旺等［22］報道，絕經前健康婦女接受卵巢切除術8周后TNF-α 表達明顯增加，其表達水平與骨吸收指標BV/TV、Tb. Th、Tb. N、Tb. Sp 和骨密度呈正相關。MARAHLEH 等［23］報道，將TNF-α與小鼠原代顱骨細胞共培養后，細胞中的RANKL mRNA 表達顯著提高，但OPG mRNA表達無明顯變化，表明TNF-α可間接增高RANKL/OPG 比例，支持破骨細胞前體存活和分化。在破骨細胞前體細胞中加入TNF-α 后，TRAP陽性細胞數顯著增加；而在TNF受體Ⅰ和Ⅱ缺陷的破骨細胞前體細胞共培養物中加入TNF-α 后，未檢出TRAP 陽性細胞。這提示TNF-α 可直接激活破骨細胞前體細胞表面TNF 受體，促進破骨前體細胞分化。由此可見，免疫系統激活導致炎癥因子表達上調能夠促進破骨前體細胞分化，加重骨質疏松。

TLRs 的表達模式在破骨細胞的不同階段各有不同，破骨細胞前體細胞表達TLR1～9，在向成熟破骨細胞分化的過程中主要表達TLR2 和TLR4，提示TLR2 和TLR4 在破骨細胞分化過程中起主要作用。來自造血干細胞的破骨細胞表達TLRs 并對DAMPs有反應，DAMPs 刺激后會引起破骨細胞前體細胞活化，從而促進破骨細胞前體細胞向破骨細胞轉化，促進骨質疏松癥的進展［24］。動物實驗顯示，在糖尿病骨質疏松小鼠中，敲除TLR4 基因可降低TRAP 陽性細胞細胞率和TNF-α mRNA 表達水平，改善骨小梁碎裂程度，認為TLR4 基因敲除可通過抑制TLR4 激活和TNF-α 釋放來減輕骨質疏松［25］。因此，調節或抑制TLR4 可作為治療骨質疏松癥的新的研究方向。ALQRANEI 等［26］報道，在破骨前體細胞中加入TLR2/4激活劑LPS后，TRAP 陽性細胞顯著增加；而在加入RANKL預培養與未加入RANKL的破骨前體細胞同時加入LPS 后，兩者之間TRAP 陽性細胞率無顯著差異，RANKL、OPG mRNA 表達水平無明顯變化，表明TLR4 激活能獨立于RANKL/RANKL/OPG 軸以外引發破骨細胞活化；在LPS 孵育的破骨前體細胞中加入TLR2/4 抑制劑TAK-242 能夠顯著降低TRAP 陽性細胞率，表明對TLR4 干預能抑制破骨前體細胞活化，延緩骨質疏松進展。

研究發現，TLRs 信號通路可將RANKL 信號通路中的下游分子隔離開來，從而抑制破骨細胞早期分化。在小鼠骨髓源性巨噬細胞和人外周血單核細胞中，同時加入RANKL 和TLRs 激活劑LPS 后，與較單純RANKL 孵育相比TRAP 陽性細胞率顯著降低，表明TLRs在破骨前體活化早期階段有負面作用；而在破骨前體細胞中加入RANKL 預處理24 h 后再加入LPS 培養48h 后，與單純RANKL 孵育72 h 相比，TRAP 陽性細胞率顯著提高，表明盡管TLRs 在破骨細胞形成的早期階段有負面作用，但在破骨前體細胞分化的后期階段具有積極作用［27］。因此，靶向TLRs 誘導的破骨前體細胞活化可能是一種有效的抑制骨質疏松癥等溶骨性疾病治療策略。

TLRs 受體不僅表達在破骨細胞前體細胞表達，在成骨細胞膜表面也有大量表達。FISCHER 等［28］從小鼠顱骨分離出成骨細胞進行培養，加入LPS后，成骨細胞膜上的TLR2、TLR4 mRNA 表達上調，RANKL mRNA 在2 h 內顯著上調，而OPG mRNA 水平相對較低，表明成骨細胞膜上TLR2/4 的激活能夠上調RANKL mRNA 表達，促進破骨前體細胞活化，進而發生骨質疏松。此外，王瑞等［29］、張倩璐等［30］報道，在孵育的成骨細胞中加入LPS后，成骨分化基因ALP 和OCN 表達受到抑制，用siRNA 轉染TLR4 后顯著增加成骨分化基因水平和成骨細胞礦化能力。總之，TLRs可以通過增加破骨前體細胞活化和抑制成骨細胞活性導致骨質疏松，成骨細胞也可能通過干擾RANKL/RANK/OPG 軸，作用于未分化破骨細胞前體細胞加劇骨質疏松。因此，通過靶向調控TLRs 及下游信號不失為一種干預骨質疏松進展的方法。

綜上所述，固有免疫系統異常激活釋放炎癥介質參與骨細胞凋亡和組織損傷過程，在椎間盤退行性變、骨關節炎、骨質疏松癥的發病機制中發揮重要作用。當前以TLRs 作為固有免疫異常激活干預靶點的研究尚處于起步階段，具體信號通路錯綜復雜，深入研究TLRs 在骨退行性疾病中的作用機制可以為骨退行性疾病的治療提供新的靶點和策略。TLRs 激活導致溶骨性改變和基質蛋白水解機制是開發新型抗骨退行性病變藥物的一種很有前途的治療策略，但是目前還局限于離體細胞或動物試驗，臨床證據不足，還需要進行更多的臨床試驗。