miRNA在股骨頭壞死修復過程中的作用研究進展

潘海達，曾平

1 永嘉縣中醫醫院傷骨科，浙江永嘉 325100；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院仙葫院區骨科

股骨頭壞死（ONFH）是指各種原因造成股骨頭局部血流動力學改變導致的髖關節疾病，具有病程纏綿、難以修復的特點。其早期癥狀不明顯，發病隱秘，大多數患者就診時股骨頭軟骨面已出現塌陷，即不同程度的微骨折。ONFH 進展不可逆，如不積極治療，將很快發展至骨關節炎階段。ONFH 的預后取決于缺血再灌注、新生股骨對死骨的爬行替代程度［1］。在ONFH 修復過程中，會經歷骨質壞死變性、壞死骨質吸收肉芽組織長入、血管組織鈣化修復三個階段，包含破骨細胞增殖壞死骨質吸收、修復帶內血管內皮細胞生長活躍及成骨細胞骨爬行替代過程［2］。miRNA 是一類小的非編碼RNA，具有轉錄后調控基因表達的功能。miRNA 表達具有高度的組織特異性，并在關鍵的生理過程中受到動態調控［3］。研究表明，miRNA 幾乎參與了所有生物過程，包括細胞增殖、分化、衰老、凋亡、腫瘤形成和應激反應［4］。現就miRNA 在ONFH 病理修復過程中作用的研究進展綜述如下。

1 miRNA參與ONFH修復過程中的血管生成

ONFH 在磁共振成像T2加權成像中具有典型的“雙線征”，其中高信號區即血管長入及肉芽組織爬行替代區域。血管長入涉及細胞增殖、遷移、分化、管形成，并受到血管生成因子的調控，miRNA參與了ONFH壞死修復過程中血管的生成及爬行替代。

血管生成受多種生長因子的調節，例如血管內皮生長因子（VEGF）和血管內皮鈣黏蛋白。研究顯示，在小鼠靜脈內皮細胞中，miR-10a 過表達可導致VEGF 和血管內皮鈣黏蛋白表達水平降低；而轉染miR-10a抑制劑后，細胞中VEGF 和血管內皮鈣黏蛋白表達水平恢復正常。miR-92a 作為血管生成的負向調節劑，在人類內皮細胞中高表達，其表達量與年齡呈負相關。MURATA 等［4］比較了4 例大轉子骨折患者和4 例健康對照者的血漿miRNA 濃度，發現骨折患者發病24 h 后miR-92a 表達水平開始降低，而發病后21 d 恢復正常；為了確定miR-92a 在骨折愈合中的作用，該研究對股骨骨折小鼠靜脈注射miR-92a 拮抗劑LNA 穩定寡核苷酸，結果顯示拮抗劑組較對照組骨痂形成、重塑良好，其血管數量、血管面積較對照組分別高出74%、200%。這表明抑制miR-92a表達可以促進血管新生，促進ONFH局部微骨折的修復和壞死組織的爬行替代。

與miR-92a 相反，miR-126 是體內血管生成信號傳導的正向調節劑。miR-126 可通過直接抑制多個靶標來增強血管內皮細胞對VEGF 的反應，包括Sprouty 相關的EVH1 結構域含蛋白1、磷酸肌醇3 激酶調節亞基2、血管細胞黏附分子1［5］，從而促進血管生成及維持血管內皮細胞的完整性。

缺氧與血管新生密不可分，缺氧誘導因子1（HIF-1）與VEGF 協同作用，在低氧低灌注條件下刺激血管新生，改善局部缺血。研究顯示，miR-18a、miR-20a、miR-20b等均參與了細胞內HIF的調控，影響血管生成［6］。同時，血管的生成與爬行替代對局部組織修復、壞死吸收具有滋養作用，特別是在承重區，即股骨頭中內、側柱，壞死區血供對于“帶塌陷”生存、血供豐富與否起到關鍵性作用。

2 miRNA參與ONFH修復過程中的骨代謝

2.1 miRNA與破骨細胞 ONFH患者股骨頭X線下“新月征”的出現，提示局部股骨頭存在病理性微骨折，其過程包含空骨陷窩的增多、破骨細胞的增殖及骨質的吸收和破壞。在ONFH發病過程中，破骨細胞對骨質的破壞與吸收對于疾病進程和預后尤為重要。

c-Fos 與破骨細胞功能調節密切相關，c-Fos 作為破骨細胞的“感受器”被核因子κB 受體激活因子（RANK）配體激活后，可以誘導破骨細胞分化［7］。c-Fos 的觸發激活過程需要miR-21 參與，同時miR-21還可以上調程序性細胞死亡4蛋白（PDCD4）表達水平，并激活c-Fos，從而激活破骨細胞。實驗發現，敲除miR-21的小鼠PDCD4蛋白表達水平受到抑制，提示破骨細胞的激活及活性與miR-21相關［8］。

與miR-21 具有相反作用的有miR-503 和miR-148a。RANK 是一種表達在破骨細胞前體上的Ⅰ型膜蛋白，miR-503的種子區與RANK mRNA的氨基酸編碼序列可互補結合。在卵巢切除小鼠中，抑制miR-503 表達可導致破骨細胞活性增強從而骨吸收增加；體外實驗表明，向人外周血單個核細胞培養基中分別轉染pre-miR-503、antago-miR-503 后用于培養破骨細胞，前者培養的破骨細胞活性降低，而后者培養的破骨細胞活性增強［9］。在一項微陣列測定中發現，has-miR-148a、has-miR-483、has-miR-223、hasmiR-21、has-miR-214 被上調，而has-miR-155、hasmiR-125a、has-miR-27b、has-miR-145 被下調；實時熒光定量PCR 結果與miRNA 微陣列結果一致，其中miR-148a 在破骨細胞分化中顯著上調；體外實驗表明，miR-148a可通過抑制NFATc1和肌肉—神經纖維肉瘤癌基因同源物B從而抑制破骨細胞活性［10］。

miRNA通過介導破骨分化及活性，影響死骨的吸收及骨質的破壞，對于壞死骨組織吸收、塌陷的進展與否，具有決定性意義。如何通過miRNA抑制破骨細胞活性，從而延緩甚至阻滯塌陷的進展，保持股骨頭球形結構完整，對于ONFH的治療具有重要意義。

2.2 miRNA 與成骨細胞 在ONFH 壞死修復過程中，“硬化帶”的出現一定程度上是成骨細胞主導的骨修復在影像學上的表現。ONFH的預后與其修復方式是“成骨性修復”還是“破骨性修復”相關［11］。因此，成骨細胞的活性對于ONFH的修復具有重要意義。

研究發現，miR-214 在體內和體外均對成骨細胞的增殖分化具有抑制作用［11］。已知轉錄激活因子4C（ATF4）對成骨細胞分化和功能具有關鍵作用，miR-214可直接與ATF4的3'-UTR位點結合，從而表現出對成骨細胞活性的抑制作用［12］。

骨形態發生蛋白（BMP）在成骨細胞生長、分化、凋亡等過程中發揮重要作用［13］。小鼠成骨細胞轉染miR-542-3p 后可抑制BMP 表達，導致成骨細胞凋亡增加及增殖減少；對成骨細胞給予miR-542-3p 干預后，細胞內半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）含量增加，Caspase-3作為成骨細胞凋亡因子，會導致成骨細胞凋亡；同樣干預BMP 形成的還有miR-133 和miR-135，過表達miR-133或miR-135會抑制堿性磷酸酶、骨鈣素和同源框A10生成，進而抑制成骨分化［14］。骨膠原蛋白代謝異常可導致ONFH、骨關節炎在內的各種骨病發生。對于成骨細胞系，miR-29b雖然不會抑制未成熟成骨細胞中的膠原蛋白表達，但會導致分化后期膠原mRNA水平下降［15］。這可能是由于miR-29b選擇性剪接不同的膠原3′-UTR位點所致［16］。

骨穩態對ONFH 的轉歸、進展具有重要作用，成骨細胞與破骨細胞處于競爭狀態。在治療ONFH時，如何在抑制破骨細胞活性的同時促進成骨細胞增殖，miRNA提供了一個新的角度。

3 miRNA 參與ONFH 修復過程中的間充質干細胞分化

間充質基質細胞（MSCs）在組織工程和再生醫學中具有廣闊的應用前景。MSCs 能夠分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞和肌細胞，其中成脂分化與骨分化存在相互抑制關系。脂肪代謝紊亂是ONFH的重要病因之一［2］，因此在ONFH 的治療中，MSCs的分化至關重要。

MSCs在分化過程中受多種信號通路交互影響，其中包含RUNX 家族轉錄因子2（Runx2）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）。miR-204可以通過抑制Runx2，從而抑制MSCs 的成骨分化，同時增強MSCs 的成脂分化。與其類似作用的還有miR-637，不同的是miR-637 作為成骨轉錄因子抗體發揮作用［17］。研究顯示，對MSCs 給予糖皮質激素干預后，miR-708 含量明顯增高，且成脂分化活躍、成骨抑制［18］。另有研究發現，miR-708 與母親DPP 同源物3（SMAD3）3′-UTR 位點相結合后，激活的SMAD3 可以干擾CCAAT轉錄因子與Runx2啟動子內的負調控元件結合，從而介導MSCs成脂或成骨分化趨勢［19］。

PPARγ 是脂肪形成的重要調控因子，其在脂肪細胞形成中具有不可替代的作用，經激活的PPARγ不僅能夠抑制成骨分化，還能明顯增加MSCs 的成脂分化［20］。miR-27b 可以抑制PPARγ 和CCAAT 轉錄因子這兩種關鍵的成脂轉錄因子，從而抑制MSCs成脂分化。同樣，miR-21 也可以通過抑制Smad3 磷酸化從而抑制MSCs成脂分化［21］。

此外，Wnt/β-Catenin 信號通路在調控MSCs 分化中起到重要作用。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、連環蛋白拮抗因子同源物1 作為miR-8485 的靶點，當miR-8485 在體內高表達時，其可激活連環蛋白拮抗因子同源物1、GSK-3β，從而激活Wnt/β-Catenin信號通路，進而促使MSCs向軟骨分化。

4 miRNA參與ONFH修復過程中的炎癥反應

研究顯示，ONFH 患者血清中的淋巴細胞數量與病情嚴重程度呈負相關［22］。減少的淋巴細胞可以產生TGF-β、IL-4、IL-10 等炎癥因子，而局部無菌性炎 癥 也 是ONFH 的 病 理 表 現［2］。miRNA 參 與 了ONFH修復過程中的炎癥反應。

TGF-β 可通過刺激PLCγ/PKCα 磷酸化，增強血紅素加氧酶1（HO-1）等多種炎癥因子表達；miR-744可與TGF-β 近端的3'-UTR 位點結合，從而減少局部炎癥反應；轉染miR-744 的人腎皮質近曲小管上皮細胞培養上清中，TGF-β含量明顯減少［23］。miR-519b則能干擾HO-1轉錄，隨著miR-519b表達降低，HO-1表達增強，表明miR-519b 可以通過TGF-β 直接參與ONFH局部炎癥反應［24］。

磷脂酶和張力蛋白同源物（PTEN）是T淋巴細胞活化的負調節劑，同時又是miR-181a 的作用靶點。miR-181a 抑制PTEN 可激活PI3K 信號通路和活化T淋巴細胞核因子5表達［25］。高表達的miR-181a激活PI3K 通路，并刺激T 淋巴細胞增殖、分化等生物過程；miR-181a還可以調節細胞對外界刺激的敏感性，改變T淋巴細胞的信號閾值，進而影響T淋巴細胞活性［26］。在ONFH 的病理過程中，無菌性炎癥反復刺激，導致局部微循環障礙，是ONFH局部持續腫脹、疼痛的重要原因之一。目前研究顯示，miNRA 與ONFH的發生、發展、預后相關，但將miRNA 作為ONFH的診斷甚至治療手段還需要進一步探索。

miRNA 是影響病理生理、疾病轉歸的重要生物因子。miRNA參與了ONFH血管生成、成骨細胞、破骨細胞、MSCs 修復過程、局部炎癥反應等生理病理過程，對ONFH 的發生、發展、診斷、治療、預后具有重要意義。目前關于miRNA 參與ONFH 修復的具體過程、機制尚處于探索階段，隨著分子生物學的發展，miRNA參與ONFH生物學的過程將逐漸明了，從而為ONFH的臨床診療提供新的思路。