丹參多酚酸鹽對大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

王永賢，賈敏，高景峰，霍濤，許立剛

丹參始載于《神農本草經》，主要作用是活血化瘀，臨床廣泛用于心、腦血管疾病的治療，丹參及其組分具有擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量、清除自由基等作用。目前丹參的活性成分丹參多酚酸鹽已用于冠心病、心絞痛、心肌梗死及其他心血管疾病的治療［1-2］。研究證明，丹參及其活性成分具有調節機體鈣平衡、清除自由基、保護線粒體以及抗氧化等生理活性［3-4］。研究表明，丹參對心肌缺血再灌注損傷及在體心臟有一定的保護作用［5］，但作用機制尚未明了。心肌細胞能量代謝障礙是缺血再灌注損傷發生的主要機制之一，己糖激酶Ⅱ（hexokinases Ⅱ，HKⅡ）是調節機體糖酵解的關鍵酶，早期研究認為，HKⅡ是癌細胞增殖的潛在治療靶點［6］，而近期研究發現，HKⅡ在心肌缺血再灌注損傷中同樣扮演著重要角色，在低流量缺血或缺氧時，葡萄糖代謝為三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），此時HKⅡ是調節該步驟的關鍵酶［7］。發生心肌缺血再灌注損傷后，胞質和線粒體中HKⅡ含量升高，該現象由Akt激活引起，其可促進機體生成ATP，恢復缺血再灌注區能量代謝。此外，HKⅡ還可以結合于線粒體外膜，參與調節壓敏電阻器陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC），影響線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP），抑制心肌細胞凋亡［8-9］。有研究表明，丹參多酚酸鹽可以抑制線粒體能量損傷［10］，但其機制尚不明確，因此本研究基于HKⅡ探討丹參多酚酸鹽對大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷的保護作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2021年2—8月。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗動物 選取50只SD雄性大鼠，平均體質量為（180±20）g，大鼠購自河北醫科大學實驗動物中心，SPF級環境下適應性飼養7 d后用于后期實驗。

1.2.2 藥品與試劑 丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司），3-bromopyruvate（HKⅡ抑制劑，美國Sigma公司），細胞色素C檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術有限公司），ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）（美國Sigma公司），HKⅡ、Bax單克隆抗體（ab131196，Abcam），MSETB緩沖液（210 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，10 mmol/L Tris-HCl，0.2%牛血清白蛋白，pH值為7.4）、SET緩沖液（280 mmol/L蔗糖，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，10 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.4）（上海酶聯生物科技有限公司），磷二亞硫酸鈉、高氯酸（上海化學試劑有限公司試劑一廠）。

1.2.3 儀器與設備 Langendorff離體心臟灌流裝置（美國RADONTI公司），生物機能檢測記錄儀（PowerLab system，AD Instrument Ltd.澳大利亞），酶標儀（BioTek公司，美國），Western blotting化學成像系統（Biored，美國）。

1.3 分組及大鼠模型制備 將50只SD雄性大鼠采用簡單隨機抽樣法分為假手術組、模型組、丹參多酚酸鹽組、HKⅡ抑制劑組、HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組，每組10只。各組大鼠腹腔注射1 000 U/kg肝素抗凝，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉；取出心臟置于0～4 ℃的0.9%氯化鈉溶液中，懸掛于Langendorff離體心臟灌流裝置上，逆行恒壓灌注，剪開右心房，使冠狀動脈流出液自然流出；采用95% O2+5% CO2混合氣飽和的K-H緩沖液（pH值7.35～7.40）在恒溫（37 ℃）、恒壓〔100 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）〕條件下灌注；剪開左心耳，將連接有測壓導管的心室球囊送入左心室，另一端連接生物機能檢測記錄儀；灌流液及心臟周圍溫度用恒溫循環水浴維持在（37.0±0.5）℃；平衡灌注30 min，待心臟各項功能穩定，關閉灌流液停止灌流，造成全心缺血，31 min后打開灌流液再次灌流30 min，制備離體心臟心肌缺血再灌注損傷模型［11］。其中假手術組不關閉灌流液；模型組建模后給予含有0.9%氯化鈉溶液（20 mg/kg）的灌流液灌流；丹參多酚酸鹽組建模后給予含有丹參多酚酸鹽（20 mg/kg）的灌流液灌流；HKⅡ抑制劑組建模后給予含有HKⅡ抑制劑（10 mg/kg）的灌流液灌流；HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組建模后給予含有丹參多酚酸鹽（20 mg/kg）及HKⅡ抑制劑（10 mg/kg）的灌流液灌流。

1.4 實驗方法

1.4.1 心臟組織細胞色素C含量檢測 取100 mg大鼠心臟組織，4 ℃條件下采用PBS勻漿，按照細胞色素C檢測試劑盒說明書，分別取0.1 mmol/L細胞色素C標準品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml加蒸餾水至1.5 ml，再加入磷二亞硫酸鈉1 ml，采用酶標儀檢測520 nm處吸光度值，繪制標準曲線計算細胞色素C含量。

1.4.2 心臟組織腺苷酸含量檢測 取300 mg大鼠心臟組織，4 ℃條件下采用PBS勻漿，收集到1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心3 min（離心半徑115 mm），去除上清液，加入200 μl高氯酸于冰上處理心臟組織勻漿液45 min；4 ℃ 12 000 r/min離心3 min（離心半徑115 mm），取上清液，經過0.22 μm微孔濾膜過濾后通過高效液相色譜（high performance liquidchromatography，HPLC）法檢測ATP、ADP、AMP含量。

1.4.3 心臟組織線粒體制備 取100 mg大鼠心臟組織，放入玻璃勻漿器中，加入MSETB緩沖液10 ml/g，手動勻漿10次。所得勻漿液以2 000 r/min離心3 min（離心半徑115 mm），取上清液，12 000 r/min離心8 min（離心半徑115 mm），所得沉淀即為線粒體，以MSETB緩沖液將所得沉淀洗滌1次。將沉淀按10∶1（V/W）懸于SET緩沖液中，整個線粒體制備過程均在4 ℃下進行。

1.4.4 mPTP吸光度檢測 采用腫脹液（120 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L MOPS，50 mmol/L KH2PO4，pH值為7.4）將線粒體稀釋至蛋白終濃度為0.25 g/L，25 ℃下將200 μmol/L CaCl2作用于線粒體，采用紫外可見分光光度計觀察520 nm 處mPTP吸光度，mPTP吸光度可反映mPTP開放情況［12］。

1.4.5 Western blotting法檢測線粒體中HKⅡ、Bax表達水平 取200 mg大鼠心臟組織，置于冰上，剪成小塊，加入1 ml RIPA裂解液，勻漿2 min，12 000 r/min離心8 min（離心半徑115 mm），取上清液，提取蛋白質，行十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），電泳條件為60 V 25 min，150 V 2 h。電泳結束后以電轉移法將蛋白從凝膠轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，采用5%脫脂奶粉封閉過夜，分別加入一抗兔抗鼠HKⅡ及Bax單克隆抗體各10 ml（工作液稀釋比例為1∶1 000）并室溫孵育2 h，然后加入二抗鼠抗兔多克隆抗體10 ml（工作液稀釋比例為1∶5 000）并室溫孵育2 h，最后將PVDF膜用ECL化學發光試劑盒（美國Viagene公司）處理并顯影，檢測HKⅡ、Bax表達水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞色素C含量 假手術組心臟組織細胞色素C含量為（257.8±23.2）μmol/mg，模型組為（357.7±31.1）μmol/mg，丹參多酚酸鹽組為（289.0±17.2）μmol/mg，HKⅡ抑制劑組為（389.5±22.3）μmol/mg，HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組為（365.2±24.1）μmol/mg，五組比較差異有統計學意義（F=166.32，P＜0.05）；其中模型組高于假手術組，丹參多酚酸鹽組低于模型組，HKⅡ抑制劑組高于模型組，HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組高于丹參多酚酸鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 腺苷酸含量 五組心臟組織AMP含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。五組心臟組織ATP、ADP含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組心臟組織ATP、ADP含量低于假手術組，丹參多酚酸鹽組心臟組織ATP、ADP含量高于模型組，HKⅡ抑制劑組心臟組織ATP含量低于模型組，HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組心臟組織ATP、ADP含量低于丹參多酚酸鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 五組心臟組織腺苷酸含量比較（±s，μmol/mg）Table 1 Comparison of adenylate content in heart tissues among the five groups

表1 五組心臟組織腺苷酸含量比較（±s，μmol/mg）Table 1 Comparison of adenylate content in heart tissues among the five groups

注：HKⅡ=己糖激酶Ⅱ，ATP=三磷酸腺苷，ADP=二磷酸腺苷，AMP=單磷酸腺苷；a表示與假手術組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與丹參多酚酸鹽組比較，P＜0.05

組別 只數 ATP ADP AMP假手術組 10 1.85±0.21 0.88±0.12 0.04±0.005模型組 10 0.67±0.17a 0.31±0.09a 0.03±0.004丹參多酚酸鹽組 10 1.34±0.14b 0.69±0.11b 0.04±0.005 HKⅡ抑制劑組 10 0.39±0.09b 0.32±0.08 0.03±0.003 HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組 10 0.47±0.14c 0.36±0.11c 0.02±0.005 F值 85.23 35.52 0.86 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.120

2.3 mPTP吸光度 假手術組mPTP吸光度為（0.032±0.012），模型組為（0.065±0.013），丹參多酚酸鹽組為（0.042±0.011），HKⅡ抑制劑組為（0.067±0.025），HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組為（0.064±0.016），五組比較差異有統計學意義（F=16.21，P＜0.05）；其中模型組高于假手術組，丹參多酚酸鹽組低于模型組，HKⅡ抑制劑組高于模型組，HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組高于丹參多酚酸鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 HKⅡ、Bax表達水平 五組線粒體中HKⅡ、Bax表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組線粒體中HKⅡ表達水平低于假手術組、Bax表達水平高于假手術組，丹參多酚酸鹽組線粒體中HKⅡ表達水平高于模型組、Bax表達水平低于模型組，HKⅡ抑制劑組線粒體中HKⅡ表達水平低于模型組，HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組線粒體中HKⅡ表達水平低于丹參多酚酸鹽組、Bax表達水平高于丹參多酚酸鹽組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖1。

圖1 五組線粒體中HKⅡ、Bax表達電泳圖Figure 1 Electrophoresis of HKⅡ and Bax expression in mitochondria among the five groups

表2 五組線粒體中HKⅡ、Bax表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of HKⅡ and Bax expression levels in mitochondria among the five groups

表2 五組線粒體中HKⅡ、Bax表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of HKⅡ and Bax expression levels in mitochondria among the five groups

注：a表示與假手術組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與丹參多酚酸鹽組比較，P＜0.05

組別 只數 HKⅡ Bax假手術組 10 1.00±0.01 1.00±0.02模型組 10 0.21±0.02a 4.30±0.04a丹參多酚酸鹽組 10 0.73±0.04b 2.60±0.05b HKⅡ抑制劑組 10 0.16±0.03b 3.90±0.08 HKⅡ抑制劑+丹參多酚酸鹽組 10 0.21±0.05c 4.20±0.05c F值 37.45 18.32 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

己糖激酶（hexokinases，HK）是機體中調節糖酵解的關鍵限速酶。在哺乳動物細胞中，HK家族主要有以下4種亞型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。在正常組織細胞中，HK及其同工酶表達水平均較低，其中表達水平最高的是HKⅠ。HKⅡ屬胰島素敏感型，正常情況下，僅在心臟、骨骼肌和脂肪組織中微量表達［13］。HKⅠ及HKⅡ均具有與線粒體結合的能力，參與調節線粒體的功能，但HKⅢ和HKⅣ沒有相關報道［14］。近年研究發現，HKⅡ除具有催化糖酵解活性的作用外，還有拮抗細胞凋亡的作用，HKⅡ可與VDAC、Bcl-2家族成員等構建mPTP，調控線粒體膜通透性，拮抗線粒體途徑的細胞凋亡［15］。所以圍繞HKⅡ在癌癥發生及發展中的研究相對較多，但近年研究發現，HKⅡ保護心肌線粒體功能，特別是在心臟缺血、低氧條件下同樣發揮重要作用［16-17］。丹參多酚酸鹽是已上市的用于治療心絞痛、冠心病等心臟病的有效藥物，研究表明，丹參多酚酸鹽在心肌缺血再灌注損傷中同樣具有良好的保護作用，可以降低心臟氧化應激的發生率，升高超氧化物歧化酶水平，改善機體抗自由基功能，減輕心肌內質網應激，恢復線粒體ATP能量供應等［18-20］，但是其具體作用機制尚不清楚。HKⅡ還可參與調控線粒體功能，而線粒體是細胞能量的合成器［21］。本研究結果顯示，丹參多酚酸鹽組心臟組織細胞色素C含量低于模型組，丹參多酚酸鹽可以降低心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心臟組織細胞色素C含量。細胞色素C是線粒體損傷的標志，當線粒體發生損傷后，線粒體中的細胞色素C含量升高［22］。給予HKⅡ抑制劑后，丹參多酚酸鹽的保護作用降低。說明丹參多酚酸鹽可能通過調控HKⅡ發揮作用。本研究結果還顯示，丹參多酚酸鹽可以明顯影響心臟組織的能量代謝，丹參多酚酸鹽可以恢復心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心臟組織ATP供應，而給予HKⅡ抑制劑后，其調控作用降低。mPTP是線粒體內膜實現通透性轉換的主要途徑。HK是組成mPTP的主要蛋白，近年研究發現，HKⅡ在心肌細胞中是構成mPTP的主要蛋白，當HKⅡ表達降低，mPTP開放增多，可以使線粒體內膜通透性急劇上升［23］，相對分子量＞1.5 kDa的大分子物質可以非選擇性地通過線粒體內膜，導致線粒體膜去極化、線粒體內膜跨膜電位持續下降以及呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯，進而出現ATP合成障礙、活性氧生成過多、基質腫脹，隨著線粒體腫脹進一步加重，折疊的內膜被打開，最終導致線粒體外膜破裂，導致線粒體中大量細胞色素C被釋放，從而誘導細胞凋亡［24-25］。本研究結果顯示，丹參多酚酸鹽可減少mPTP開放，恢復線粒體能量供應，而給予HKⅡ抑制劑后，丹參多酚酸鹽的上述作用減弱。Western blotting法實驗結果顯示，丹參多酚酸鹽可以有效提高HKⅡ表達水平，并抑制凋亡蛋白Bax表達水平，說明丹參多酚酸鹽可以提高心肌細胞中HKⅡ表達水平，促進細胞能量代謝的增加，從而恢復細胞的能量供應，減少心肌缺血再灌注損傷的發生。HKⅡ是機體中調節糖酵解的關鍵限速酶，其參與細胞糖酵解反應，而糖酵解反應是細胞能量供應在無氧條件下的主要方式之一，因此丹參多酚酸鹽可能通過促進細胞糖酵解反應，補充能量代謝，發揮其保護作用，但其作用機制還有待明確。

綜上所述，丹參多酚酸鹽可降低大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷模型心臟組織細胞色素C含量、mPTP吸光度、線粒體中Bax表達水平，升高心臟組織ATP、ADP含量、線粒體中HKⅡ表達水平，丹參多酚酸鹽可以通過調控HKⅡ，進而改善心肌細胞線粒體能量供應，發揮改善大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷的作用，但是丹參多酚酸鹽如何參與調控HKⅡ的分子機制還有待進一步明確，其作用靶點需在后續的研究中發現。

作者貢獻：賈敏進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理；王永賢進行研究的實施與可行性分析，資料收集；高景峰進行資料整理；王永賢、霍濤進行論文的撰寫及修訂；許立剛進行統計學處理。

本文無利益沖突。