穴位埋線通過 SIRT1/NF-κB信號通路對潰瘍性結腸炎腸道屏障功能的影響

李玎玎,劉朝霞

(1.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,哈爾濱 150040)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)以結腸黏膜慢性非特異性炎癥為特征,臨床表現為腹瀉、腹痛和膿血便,病情呈逐漸進展,極易反復發作,為消化內科常見的難治性疾病[1]。UC腸黏膜反復的炎癥反應不僅加重患者病情,也是導致其癌變的危險因素,緩解和控制炎癥是UC臨床治療的重要方向[2]。目前常規的治療方案包括抗生素、消炎藥、糖皮質激素和免疫抑制劑等,這些藥物在 UC急性期具有較好療效,而長期使用可導致嚴重不良反應和感染風險[3]。穴位埋線是在傳統針刺基礎上發展而來的一種中醫外治方法,能夠通過對穴位的持久刺激發揮對機體的整體調節效果,受到了臨床醫師的廣泛關注[4]。在臨床試驗和動物模型中發現穴位埋線對UC具有較好的治療效果,能夠有效恢復腸黏膜炎性損傷[5-6]。核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)介導的炎癥信號在UC的發病機制中扮演重要角色,近年研究發現沉默信息調節因子1(silent information regulator 1, SIRT1)的表達和激活可抑制 NF-κB信號的活化,降低腸黏膜炎癥反應[7]。本研究通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)法進行UC大鼠造模,通過SIRT1/NF-κB通路探討穴位埋線療法對大鼠腸黏膜炎癥和屏障功能的影響,探究其發揮治療作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與方法

選取SPF級遠交群(Sprague Dawley, SD)雄性大鼠42只,體質量180～220 g,由黑龍江中醫藥大學提供,動物許可證號SYXK黑2021-010。于溫度(23±3)℃,相對濕度40%～70%,光照和黑暗12 h交替的SPF級實驗動物房中適應性飼養1周。所有動物實驗均經黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院實驗動物福利倫理委員會審核通過(倫理審批號20210203)。

1.2 主要試劑、材料與儀器

柳氮磺胺吡啶(Salazosulfapyridine, SASP)腸溶片(上海福達制藥有限公司,批號 990608),葡聚糖硫酸鈉(DSS)(美國MPBiomedicals公司,批號M8669);大鼠髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)酶聯免疫吸附試驗(enzyme- linked immunosorbnent assay,ELISA)檢測試劑盒(深圳達科為生物技術有限公司,批號 20210522),抗 SIRT1、核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB) p65 、 磷 酸 化 核 因 子 -κB p65(phosphorylated NF-κB p65)、核因子κB 抑制因子α(inhibitor kappa B alpha, IκBα)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(phosphorylated inhibitor kappa B alpha, p-IκBα)、IκB 激酶β(IκB kinaseβ, IKKβ)、磷酸化 IκB 激酶β(phosphorylated IκB kinaseβ,p-IKKβ)、乙酰化核因子κB-p65(acetylated nuclear factor- κB p65, AC-p65)一抗(美國 Santa Cruz 公司,批號 072301、051907、059208、052860、054061、053157),RNA提取、反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司,批號DR060A、D543A),基因上下游引物(上海捷瑞生物工程有限公司,貨號 S0415);7號無菌埋線針(鎮江高冠醫療器械有限公司),可吸收外科縫線(山東博達醫療有限公司);生物組織切片機(德國Leica公司,型號RM 2235),光學顯微鏡(德國Leica公司,型號DM750),酶標儀(瑞士 Tecan 公司,型號 GENIOSPLOS),電泳儀和蛋白轉膜儀(美國 Bio-Rad公司,型號 EC3型),RCR儀(美國ABI公司,型號9902)。

1.3 造模和干預方法

在42只SD大鼠中隨機抽取10只作為空白組,其余大鼠自由飲用3% DSS水溶液7 d以進行UC造模[8]。觀察大鼠造模期間一般狀況,7 d后隨機抽取2只大鼠,解剖后取結腸組織,用蘇木精-伊紅(hematoxylineosin, HE)染色法觀察結腸組織病理學變化。以出現腹痛、腹瀉、膿血便等癥狀及腸黏膜糜爛、潰瘍、炎性浸潤等病理損傷為模型成功標準[9]。模型制備成功后,將UC大鼠按體質量隨機分組為模型組、藥物組和穴位埋線組,每組10只。藥物組予柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液(按每千克體質量 0.5 g)灌胃給藥,每日1次,持續14 d;穴位埋線組予穴位簡易埋線療法,取雙側足三里、天樞、上巨虛和大腸俞穴,穴區脫毛備皮及常規消毒后,將0.5 cm羊腸線放入7號無菌埋線針內,推入上述腧穴(足三里和上巨虛穴采用直刺法,天樞和大腸俞穴從下方向上平刺),針刺達到皮下或肌層后退出針芯和針管,線頭不外露,消毒干棉球按壓針孔。每7 d治療1次,共3次;空白組和模型組大鼠正常喂養,不予處理。

1.4 觀察指標

1.4.1 疾病活動度指數(disease activity index,DAI)和黏膜損傷指數(colon mucosa damage index,CMDI)評分[10]

DAI以體質量、糞便性狀和潛血情況為評分標準。體質量不變計0分,體質量較前減輕1%～5%計1分,體質量較前減輕 6%～10%計 2分,體質量較前減輕11%～15%計3分,體質量較前減輕＞15%計4分。糞便性狀無異常計0分,糞便松散、半稀疏狀計2分,糞便稀疏而黏稠計4分。大便無潛血計0分,大便潛血陽性計2分,肉眼可見血便計4分。DAI評分為體質量、糞便性狀和潛血3項評分的均值。

CMDI以結腸黏膜病變程度為評分標準。腸黏膜無損傷計0分;腸黏膜輕度充血、水腫,未見糜爛和潰瘍者計1分;腸黏膜輕中度充血、水腫,可見糜爛和粘連計 2分;腸黏膜高度充血、水腫,可見壞死和潰瘍(直徑＜1 cm)計3分;腸黏膜可見較大潰瘍(直徑≥1 cm)和全腸壁壞死計4分。

1.4.2 結腸組織病理學變化

干預后,大鼠經腹主動脈采血后處死,取大鼠部分結腸組織,于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,經梯度乙醇溶液脫水,二甲苯浸泡透明后采用液體石蠟包埋,切片機作5 μm組織切片,經蘇木精染色,鹽酸乙醇分化,伊紅染色后,再置于梯度乙醇中脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,觀察結腸組織病理形態改變并拍照,并對4組大鼠進行組織病理學評分。炎細胞浸潤分為無0分、輕度1分、重度2分,浸潤深度分為黏膜層1分、黏膜及黏膜下層2分、結腸全層3分,潰瘍深度分為無0分、上皮1分、黏膜固有層2分、黏膜肌層3分,各項相加得總評分[11]。

1.4.3 血清和結腸組織中MPO水平

4組大鼠麻醉后經腹主動脈采血,置于無菌試管中,3 000 r·min-1速度離心(離心半徑 4 cm)15 min,取上清,分裝凍存備用;同時取結腸組織,加入預冷生理鹽水后勻漿機研磨制成10%組織勻漿,3 000 r·min-1速度離心15 min取上清,凍存備用。血清及組織勻漿上清于室溫環境平衡 1 h,3 000 r·min-1速度離心15 min,加入待測樣品10 μL、酶標抗體100 μL和樣品稀釋劑 40 μL,同時作空白孔和標準孔,置于 37 ℃恒溫箱中孵育1 h,隨后洗板6次,加入底物溶液,37 ℃下避光孵育15 min,加入終止液,于酶標儀450 nm下檢測各反應孔OD值。根據標準品濃度和OD值繪制標準曲線,代入樣品孔 OD值,得出血清和組織勻漿樣本中MPO的水平。

1.4.4 結腸組織中NF-κB p65的陽性表達

干預后,大鼠經腹主動脈采血后處死,取部分結腸組織,置于4%甲醛溶液中固定48 h,經梯度乙醇脫水,二甲苯浸泡透明后包埋,作5 μm厚石蠟切片。切片經脫蠟、透明和脫水后,滴加3%過氧化氫室溫孵育20 min,于pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中加熱煮沸,進行抗原熱修復,滴加BSA封閉液孵育20 min,加入一抗4 ℃過夜,加入二抗,37 ℃反應 20 min,滴加 SABC,37 ℃反應20 min,滴加DAB顯色,中性樹脂封片后觀察拍照,每例樣本隨機取5個視野,計數陽性表達細胞數。

1.4.5 結腸組織中SIRT1/NF-κB通路相關蛋白表達

治療結束后,大鼠經腹主動脈采血后處死,取結腸組織100～200 mg,分裝置于﹣80 ℃冰箱凍存。4組分別選取 5例樣本,組織解凍后剪碎,勻漿機勻漿,加入RIPA裂解液,冰上裂解提取組織總蛋白,采用BCA法于562 nm波長下測定總蛋白濃度。分別上樣10 μL蛋白樣品,經凝膠電泳分離,PVDF轉膜后加入 5%封閉液封閉 2 h,滴加 IκBα、p-IκBα、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65、AC-p65和SIRT1一抗(1:1 000),于4 ℃冰箱過夜,次日 TBST清洗,滴加二抗(1:5 000),室溫環境孵育2 h, TBST洗膜,滴加ECL顯影劑,凝膠成像系統曝光成像,用Image J軟件分析各條帶灰度值,以GAPDH為內參計算SIRT1/NF-κB通路蛋白的相對表達量。

1.4.6 結腸組織中上皮鈣黏附素(epithelial calcium-dependent cell adhesion molecule,E-cadherin)和緊密連接蛋白的閉合蛋白(occludin)的mRNA表達

干預后,大鼠經腹主動脈采血后處死,取結腸組織50 mg,分裝保存于﹣80 ℃冰箱。4組分別選取5個樣本,組織解凍后剪碎成若干塊,用 Trizol一步法提取結腸組織總RNA,紫外分光光度法檢測總RNA濃度,將組織 RNA逆轉錄得到 cDNA后,以 cDNA為模板檢測E-cadherin和 occludin的 mRNA水平。E-cadherin正向引物 5’-CGTGAATGAAGCCCCCATCT-3’,反向引物3’-AAATGGCACCAGTCTCTGGG-5’。Occludin正向引物5’-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3’, 反 向 引 物5’-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3’。GAPDH正向引物5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’,反 向 引 物 5’-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3’。95 ℃ 5 min預變性,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環后,72 ℃再延伸5 min,以GAPDH為內參,mRNA相對表達量采用 2﹣ΔΔCt法分析。

1.5 統計學方法

所有數據采用SPSS20.0統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示,組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。采用GraphPad Prism 5.0軟件制圖。

2 結果

2.1 4組大鼠DAI和CMDI評分及體質量比較

造模后,與空白組比較,其余3組大鼠DAI和CMDI評分明顯升高(P＜0.05),體質量明顯減輕(P＜0.05)。干預后,藥物組和穴位埋線組大鼠DAI和CMDI評分與模型組比較均顯著降低(P＜0.05),體質量明顯增加(P＜0.01)。詳見表1。

表1 4組DAI和CMDI評分及體質量比較(±s, n＝10)

表1 4組DAI和CMDI評分及體質量比較(±s, n＝10)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05。

組別 DAI/分 CMDI/分 體質量/g空白組 0.00±0.00 0.45±0.12 238.69±13.85模型組 3.02±0.431) 3.37±0.581) 193.16±17.611)藥物組 1.28±0.311)2) 1.32±0.251)2) 221.96±19.171)2)穴位埋線組 1.44±0.261)2) 1.47±0.301)2) 217.85±16.431)2)

2.2 4組大鼠結腸組織病理形態比較

病理學檢查結果可見,空白組大鼠結腸黏膜結構正常,腺體形態規則,杯狀細胞排列整齊,未見水腫、潰瘍及炎性浸潤;模型組結腸黏膜可見明顯壞死、糜爛和潰瘍形成,腺體排列不規則,杯狀細胞減少,黏膜下層較多炎性細胞浸潤,病理學組織評分明顯高于空白組(P＜0.01);藥物組和穴位埋線組經干預后,腸黏膜糜爛、潰瘍較模型組明顯減輕,腺體和杯狀細胞數目增多,排列較規則,黏膜充血、水腫和炎性浸潤顯著改善,病理學評分明顯低于模型組(P＜0.01)。詳見圖1和圖2。

圖1 4組結腸病理組織學評分比較(±s, n＝10)

圖2 4組大鼠結腸組織病理形態比較

2.3 4組大鼠血清和結腸組織MPO活性比較

與空白組比較,模型組大鼠血清和結腸組織中MPO的水平明顯升高(P＜0.05);藥物組和穴位埋線組經干預后,大鼠血清和結腸組織 MPO的水平較模型組明顯降低(P＜0.05)。詳見表2。

表2 4組血清和結腸組織MPO活性比較(±s, n＝10)單位:(ng·mL﹣1)

表2 4組血清和結腸組織MPO活性比較(±s, n＝10)單位:(ng·mL﹣1)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05。

組別 血清MPO 結腸MPO空白組 12.15±2.43 1.26±0.58模型組 28.30±3.651) 5.73±1.061)藥物組 16.68±1.871)2) 2.34±1.141)2)穴位埋線組 19.37±2.411)2) 2.92±0.871)2)

2.4 4組大鼠結腸組織NF-κB p65表達的比較

空白組大鼠結腸組織見少量 NF-κB p65表達;與空白組比較,模型組結腸組織細胞質著色較深,NF-κB p65的陽性細胞表達數顯著增多(P＜0.05);藥物組和穴位埋線組大鼠經干預后,結腸組織細胞質陽性染色減弱,NF-κB p65陽性細胞表達數較模型組明顯減少(P＜0.05)。詳見圖3。

圖3 4組大鼠結腸組織NF-κB p65表達(IHC×400,±s, n＝10)

2.5 4組大鼠結腸組織SIRT1/NF-κB通路蛋白表達的比較

與空白組比較,模型組大鼠結腸組織中 p-IκBα、p-IKKβ和 NF-κB p65、p-NF-κB p65 及 AC-p65 的蛋白表達顯著增多,SIRT1的蛋白表達明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較,藥物組和穴位埋線組結腸組織中 p-IκBα、p-IKKβ、NF-κB p65、p-NF-κB p65、AC-p65的蛋白表達顯著下調,SIRT1的表達明顯上調(P＜0.05)。詳見圖4。

圖4 4組大鼠結腸組織SIRT1/NF-κB通路蛋白表達(±s, n＝10)

2.6 4組大鼠結腸組織 E-cadherin和 occludin的mRNA表達的比較

與空白組比較,模型組大鼠結腸組織中E-cadherin、occludin的 mRNA表達顯著減少(P＜0.05)。與模型組比較,藥物組和穴位埋線組E-cadherin和 occludin的 mRNA表達明顯增多(P＜0.01)。詳見圖5。

圖5 4組大鼠結腸組織E-cadherin和occludin的mRNA表達(±s, n＝10)

3 討論

隨著近年生活節奏的加快和膳食結構的改變,UC發病率逐年攀升,其病程遷延,難以治愈,且伴有一定癌變風險,嚴重影響患者的身心健康[12]。目前西醫對UC尚無理想治療方案,針對其臨床癥狀,常采用抗感染、免疫抑制劑等藥物進行治療,但西藥治療存在不良反應多、停藥后易復發等缺點[13]。穴位埋線作為中醫特色的外治療法,通過對特定腧穴的持久刺激來激發經絡氣機,達到調和氣血陰陽,疏通經脈的作用,且價格低廉,副作用少,在 UC的非手術療法中具有較大優勢[14]。

中醫學將UC歸屬為“腸癖”“痢疾”等范疇,認為其病位在大腸,發病與脾、胃密切相關,以脾虛濕蘊為本,血瘀凝滯為標,治宜化瘀活血,溫陽通絡[15]。穴位埋線療法是一種以經絡理論為基礎的中醫外治手段,通過將羊腸線埋入穴位并放置一定時間,以產生較常規針刺更為持久的針感刺激,起到激發經絡氣機,疏通經脈的作用;羊腸線在體內分解和吸收的過程亦可增強人體免疫功能,提高機體應激能力[16]。在臨床應用中對慢性胃炎、腸炎、UC等慢性病均有顯著療效[17]。根據UC的病因病機,臨床取穴主要以足陽明胃經、足太陽膀胱經腧穴為主。足陽明經屬胃絡脾,多氣多血,與脾胃功能和能量代謝關系密切,為治療 UC的根本所在;足太陽經屬“陽中之陽”,可參與經脈氣血循環,振奮脾陽[18]。溫淑婷等[19]通過梳理近 15年穴位埋線治療UC的選穴規律發現,選擇經脈以足陽明經和足太陽經居多,腧穴使用頻次以足三里、天樞和大腸俞最高。

SASP是治療UC的常用藥物,該藥進入結腸后經細菌分解為 5-氨基水楊酸和磺胺吡啶,5-氨基水楊酸可通過影響腸黏膜組織花生四烯酸的代謝,清除自由基等發揮抗炎作用,緩解腸道炎癥[20]。本研究選取足太陽經大腸俞及足陽明經足三里、上巨虛、天樞穴,通過DSS自由飲用法復制UC大鼠模型,同時選擇SASP作為陽性對照藥物,觀察埋線治療對 UC腸黏膜的修復效果。足三里為胃的下合穴,針刺有疏調陽明經氣、調理腸胃運化之效;天樞為大腸之募穴,主調暢腸腑氣機,化瘀活血;上巨虛為大腸之下合穴,與天樞穴合募配伍,可起到調腸和胃作用,與足三里合用,又可提高機體免疫機能;大腸俞為大腸之背俞穴,與天樞穴俞募相配,有理氣降逆、調和大腸腑氣之功用[21]。UC大鼠經穴位埋線治療后,DAI和CMDI評分較模型組顯著降低,體質量顯著增長,結腸黏膜潰瘍、糜爛和炎性浸潤等病理表現得到有效改善,同時顯著降低了大鼠血清和結腸組織中炎癥指標 MPO的活性,提示埋線療法能夠顯著減輕UC大鼠結腸組織中性粒細胞浸潤程度,促進腸黏膜損傷愈合。

NF-κB作為一條經典的炎癥通路,在促進炎性細胞因子表達,誘發機體炎癥反應方面具有重要作用[22]。在靜息狀態下,NF-κBp50/p65通過與IκB結合在細胞質中保持非活性狀態;當機體受到外部刺激時,IKK發生磷酸化,并促使IκB磷酸化和降解,降解的IκB進入細胞核后激活 NF-κB,進而促進炎癥反應的發生和持續[23]。以往研究表明[24-25],在 UC動物模型和患者中存在 NF-κB通路的過度激活,而通過靶向抑制其活化能夠緩解結腸組織炎癥損傷,對UC起到治療作用。本研究發現,UC大鼠結腸組織中NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IKKβ、p-IκBα及 AC-p65的蛋白水平均顯著上調,p-IκBα/IκBα、p-IKKβ/IKKβ的比值明顯增加,經穴位埋線治療后,NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IKKβ、p-IκBα及 AC-p65 的 表 達 顯 著 減 少 ,p-IκBα/IκBα 和p-IKKβ/IKKβ比值明顯降低,表明穴位埋線能夠作用于 NF-κB通路,通過抑制 NF-κB磷酸化和乙酰化發揮對UC的抗炎修復作用。SIRT1是從酵母中分離的一類去乙酰化酶,在炎癥性腸病中,活化并處于高水平的SIRT1能通過調節腸道菌群、抑制炎癥來維持腸黏膜屏障功能,保護腸上皮細胞[26]。此外,高表達的 SIRT1還可使 NF-κB去乙酰化,通過抑制 NF-κB的活性以減輕炎癥程度。SIRT1表達的降低可減少對NF-κB 信號通路的抑制作用,導致炎癥因子表達升高[27]。陳銳等[28]研究證實,SIRT1可通過抑制NF-κB的表達來降低壞死性小腸結腸炎中炎癥因子的水平。在本實驗中,UC大鼠結腸 SIRT1的蛋白表達顯著減少,而埋線治療明顯上調了 SIRT1的水平,提示穴位埋線可能通過促進SIRT1的表達,抑制NF-κB及其下游炎癥因子生成以保護UC腸黏膜損傷。

腸黏膜屏障可抵御有害物質的侵襲,在腸道中具有重要的防御功能。UC患者腸鏡檢查可見黏膜屏障的破壞,腸屏障功能的受損可引起機體免疫異常,使炎癥反應和腸上皮細胞損傷進一步加重,導致 UC遷延反復[29]。研究[30]證實,NF-κB的過度活化將導致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎癥介質的過度表達,引起腸黏膜炎癥反應,從而造成屏障的損傷。NF-κB阻斷劑能夠通過上調 occludin、E-cadherin的水平以改善腸屏障功能[31]。熊興軍等[32]發現,木瓜總三萜可通過調節SIRT1/NF-κBp65通路上調Occludin、E-cadherin等腸黏膜屏障保護因子的表達以減輕腸黏膜屏障損傷,發揮對 UC小鼠的治療作用。本研究檢測大鼠結腸組織occludin和E-cadherin的mRNA表達發現,UC大鼠E-cadherin、occludin的mRNA表達明顯降低,應用埋線治療后,明顯上調了其表達水平。提示穴位埋線能夠促進腸上皮緊密連接蛋白的表達,恢復UC受損的腸屏障功能。

綜上所述,本研究表明穴位埋線療法可顯著改善大鼠腸黏膜的炎癥,降低DAI、CMDI及病理組織學評分,其作用機制可能與調控SIRT1/NF-κB信號通路、上調黏膜屏障保護因子水平及修復黏膜上皮屏障功能相關。